概述
Annexin V/PI 双染色是流式细胞术检测细胞凋亡最经典的方法。Annexin V 结合外翻到细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸（PS），识别早期凋亡；PI 染色渗入膜完整性丧失的细胞，区分晚期凋亡和坏死。FlowJo 在分析这类数据时，需要完成 FCS 导入、FSC/SSC 设门、单细胞门、补偿调节、四象限设门与比例统计。本指南面向研究生和实验人员，讲解 FlowJo 中 Annexin V/PI 凋亡分析的完整操作流程。
数据导入与分组
1. 导入 FCS 文件
将所有样本 FCS 文件拖入 FlowJo Workspace，包括：
- 实验样本：诱导剂处理组（不同浓度或时间点）
- 对照组：未诱导的阴性对照、阳性对照（如 Staurosporine 处理）
- 单染对照：Annexin V-FITC 单染管、PI 单染管（用于补偿）
- 空白对照：未染色细胞
2. 建立分组
- 创建 Group：“处理组""对照组""单染对照”
- 将对应样本拖入相应 Group
- 按处理条件重命名样本（如”STS 1μM 4h""DMSO 对照”）
3. 确认荧光通道
双击样本查看图形，确认：
- Annexin V-FITC 信号在 FITC 通道（通常为 FL1）
- PI 信号在 PE 或 PI 通道（通常为 FL2 或 FL3）
- 记录具体通道名称，后续设门和补偿需要
操作步骤
步骤一：圈取总细胞门
- 双击样本打开 FSC-A vs SSC-A 散点图
- 用多边形门圈取完整细胞主群，排除左下角碎片和右上角聚集体
- 命名为”Cells”
步骤二：排除双联体（单细胞门）
- 双击”Cells”门，将 Y 轴改为 FSC-H
- 圈取 FSC-A vs FSC-H 对角线上的单细胞群
- 命名为”Single Cells”
- 关键：双联体会导致一个活细胞和一个死细胞粘连，被误判为双阳性，必须排除
步骤三：设置补偿
Annexin V-FITC 和 PI 的发射光谱有重叠，必须补偿：
- 打开补偿窗口，指定 Annexin V-FITC 单染管为 FITC 通道对照，PI 单染管为 PI 通道对照
- 点击
Calculate自动计算补偿矩阵 - FITC→PI 和 PI→FITC 的补偿值通常在 5%-20% 之间
- 手动验证：单染管在非目标通道的中位数应等于未染色对照
- 将补偿矩阵应用到所有实验样本
- 详见补偿设置操作指南
步骤四：四象限设门
- 双击”Single Cells”门，将 X 轴设为 FITC-A（Annexin V），Y 轴设为 PI 通道
- 选择象限门工具（Quadrant Gate）
- 在散点图上点击放置象限十字线
- 象限线定位：
- 用空白未染色对照定位左下角（双阴性）象限边界
- 用 Annexin V 单染管定位 FITC 阳性边界
- 用 PI 单染管（热激或乙醇固定细胞）定位 PI 阳性边界
- 象限线应紧贴双阴性群体右上角，避免将阴性细胞误判为阳性
步骤五：四象限含义与命名
| 象限 | 位置 | 含义 | 典型比例 |
|---|---|---|---|
| Q4（左下） | Annexin V⁻PI⁻ | 活细胞 | 对照组 >90% |
| Q3（右下） | Annexin V⁺PI⁻ | 早期凋亡 | 诱导后 10%-30% |
| Q2（右上） | Annexin V⁺PI⁺ | 晚期凋亡/继发性坏死 | 视处理强度 10%-50% |
| Q1（左上） | Annexin V⁻PI⁺ | 原发性坏死 | 正常 <5% |
在 FlowJo 中右键各象限，按上述含义重命名，便于统计。
步骤六：批量应用与统计
- 将一个样本的完整门树拖到 Group 上 →
Apply to Group - 检查各样本门位置，必要时微调
- 右键 Group →
Generate Table，导出各象限百分比和事件数 - 总凋亡率 = 早期凋亡（Q3）+ 晚期凋亡（Q2）
结果导出
1. 导出统计数据
- 右键 Group →
Generate Table→ 选择 CSV 格式 - 表格包含每个样本的各象限事件数、百分比
- 在 Excel 中计算平均值、标准差，绘制柱状图
2. 导出四象限散点图
- 将各样本的四象限图拖入 Layout Editor
- Layout Editor 支持批量排版，可按处理组排列
- 右键 Layout →
Export→ 选择 PDF（论文用）或 PNG（演示用） - 设置分辨率：论文图表至少 300 dpi
3. 导出门策略
- 保存 .wsp 文件，包含所有门和补偿设置
- 命名规则建议：
凋亡分析_日期_操作人.wsp
常见问题
1. 对照组凋亡率过高（>10%）
原因：细胞处理机械损伤、细胞状态差、或象限线画偏。 解决：优化消化和离心条件（详见四象限异常排查）；用空白对照重新定位象限线；检查细胞培养状态。
2. 诱导组无凋亡信号（全双阴性）
原因：Annexin V 失效、结合缓冲液无钙离子、或诱导剂浓度不足。 解决：检查结合缓冲液 Ca²⁺ 浓度（应 2.5 mM）；更换 Annexin V 试剂；设置阳性对照验证。
3. 细胞群呈对角线分布（FITC 和 PI 同时升高）
原因：补偿不足，PI 信号溢入 FITC 通道。 解决：重新做单染补偿；PI 单染管必须用强阳性坏死细胞（热激或固定处理）。
4. PI 单阳性象限比例过高（>20%）
原因：细胞机械破碎、冻融损伤、或培养过程中已大量死亡。 解决：检查细胞活率（应 >95%）；温和操作，降低离心力；排除死细胞后再染色。
5. 象限分群不清晰
原因：荧光信号弱、电压设置不当、或细胞自发荧光高。 解决：调整 PMT 电压使阴性群体位于 10² 以内；检查 Annexin V 用量；必要时更换荧光素（如 APC 替代 FITC）。
注意事项
- 对照体系完整：每批实验必须包含空白对照、单染对照、阳性和阴性对照，没有对照的凋亡结果不可信
- 染色后及时上机：Annexin V/PI 染色后 1 小时内完成检测，放置过久活细胞会坏死
- 结合缓冲液含钙：全程使用含 2.5 mM CaCl₂ 的结合缓冲液，严禁含 EDTA
- 事件数充足：每管至少采集 20000 个细胞，保证统计可靠性
- 报告规范：分别报告早期凋亡、晚期凋亡、坏死比例，不要只报”总凋亡率”
- 数据可重复性：每批实验至少 3 次生物学重复，结果以均值±标准差表示
掌握 FlowJo 凋亡分析需要结合实验操作和数据分析两方面，建议先做预实验优化染色和上机条件，再进行正式数据分析。