参考说明
先分清酶版本与反应兼容性
同一酶名的常规、HF 或其他厂商版本不能只凭名称共享缓冲液、温度或反应时长。下面仅摘录 NEB 甲基化表中的指定条目，不等于双酶切方案。
已核对的识别位点与甲基化信息
窄屏可左右滑动表格；也可聚焦表格后使用左右方向键。
| NEB 酶条目 | 识别 / 切割位点（5′→3′） | Dam | Dcm | CpG |
|---|---|---|---|---|
| EcoRI / EcoRI-HF | G/AATTC | 不敏感 | 不敏感 | 某些重叠组合可阻断 |
| BamHI / BamHI-HF | G/GATCC | 不敏感 | 不敏感 | 不敏感 |
| HindIII / HindIII-HF | A/AGCTT | 不敏感 | 不敏感 | 不敏感 |
| BglII | A/GATCT | 不敏感 | 不敏感 | 不敏感 |
| KpnI-HF | GGTAC/C | 不敏感 | 不敏感 | 不敏感 |
来源：NEB Dam-Dcm and CpG Methylation。表中“不敏感”对应原表 ●；重叠影响需要结合位点两侧序列。NEB 明确该表是指南，复杂情况应查 REBASE。EcoRI、BamHI 与 HindIII 的 Dam/Dcm 情况应按上表区分，不应把甲基化笼统理解为必然阻断。
双酶切要另外核对
窄屏可左右滑动表格；也可聚焦表格后使用左右方向键。
| 字段 | 核对内容 |
|---|---|
| 产品 | 两种酶的厂商、货号与版本，不能把 HF 结论自动扩展到常规酶 |
| 缓冲液 | 两酶在同一缓冲液中的实际活性，而不是“都叫 CutSmart 就兼容” |
| 条件 | 温度、反应时长、DNA 量、总反应体积与酶液贡献 |
| 底物 | 甲基化来源、切点两侧序列、近末端切割要求与 DNA 质量 |
| 后处理 | 热失活或纯化要求；不能假定分步孵育中间都无需处理 |
使用 NEB 双酶切工具时选实际产品，再对照产品说明。具体兼容性、时间和酶量应在工具与产品说明中逐项确认；未列出的酶请查原始表，不按相似位点推断。
切不开时保留单酶对照和完整条件记录，结合酶切不完全排查定位，不能只用甲基化解释全部失败。
来源与核对日期
识别位点与甲基化五行逐项对应 NEB 原表；双酶切工具仅作为进一步查询入口。核对日期：2026-11-04。
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