细胞周期分析原理与染色步骤回顾
细胞周期分为 G0/G1 期（二倍体 DNA，2n）→ S 期（DNA 合成中，2n→4n 连续分布）→ G2/M 期（四倍体 DNA，4n）。用 PI（碘化丙啶） 嵌入 DNA 双链中，荧光强度与 DNA 含量成正比。流式细胞仪检测每个细胞的 PI-A（面积）荧光信号，即可得到 DNA 含量直方图。
染色关键步骤回顾（如果染色出问题，再怎么分析也没用）：
- 收集细胞（包括上清中的悬浮死细胞，胰酶消化后合并，不能丢）
- 用预冷 PBS 洗 1 次，1500 rpm 离心 5 min
- 缓慢滴加 70% 冰乙醇（边滴边涡旋，避免细胞成团），4°C 固定过夜（≥ 16 h 效果更好）
- 离心弃乙醇，PBS 洗 1 次
- 加 PI/RNase 工作液（PI 50 µg/mL + RNase A 100 µg/mL），37°C 避光孵育 30 min
- 4°C 避光，上流式检测
RNase A 是必须的：如果不加 RNase，RNA 也会结合 PI，G1 峰右肩会拉宽，CV 极差。RNase 的浓度（100 µg/mL）和 37°C 消化时间（30 min）都要保证。
FlowJo 分析完整步骤
第 1 步：建立实验模板
- File → New Workspace
- 把所有 FCS 文件拖入 workspace，Add Samples
- 选中一个空白未染色对照和一个样品管用于设门
第 2 步：圈活细胞门（FSC-A × SSC-A）
拖入样本到 Layout，创建第一个散点图：
- X = FSC-A（前向散射，细胞大小）
- Y = SSC-A（侧向散射，颗粒度/复杂度）
- 圈出活细胞主群（Live Cell Gate）
- 左上偏亮的大块是细胞碎片、凋亡小体，不圈
- 右上很大的颗粒是细胞团/杂质，不圈
- 通常活细胞在 FSC 中间、SSC 偏低的椭圆形区域
细胞周期的固定样品（乙醇固定）细胞死亡很多，但我们要分析的是所有有完整细胞核的细胞（即便是死细胞只要核完整也能提供周期信息），因此圈门比活细胞实验略宽一点即可。
第 3 步：单细胞门（排除粘连双连体细胞）
这一步决定了 G2/M 峰是否可信。很多新手跳过这步导致 G2/M 比例虚高，甚至被审稿人质疑。
从 Live Cell Gate 创建新的散点图：
- X = FSC-A（面积）
- Y = FSC-H（高度）
正常单细胞位于 FSC-A 和 FSC-H 线性相关的对角线上。粘连的两个细胞：
- 面积 FSC-A ≈ 2 倍单细胞
- 高度 FSC-H ≈ 1 倍单细胞（两个细胞叠在一起，高度不会翻倍）
- 因此会落在对角线右下方偏外区域
用多边形工具沿对角线画一条窄带作为单细胞门（Single Cell Gate）。通常只取这条线上下 10–15% 宽度的窄带，越严格结果越好。
重要提示：如果有 FSC-W（宽度），推荐用 FSC-A × FSC-W 组合代替 FSC-A × FSC-H，分辨率更高。同样原理：单细胞 Width 小，双连体细胞 Width 大。
第 4 步：DNA 含量直方图
从 Single Cell Gate 创建直方图：
- X = PE-A（或 PI-A / PerCP-Cy5.5-A，具体看你机器上用的哪个通道采集 PI），坐标选 Linear（线性），不要用 Log！
- X 轴范围 0–250k（如果峰出不来，调大到 0–500k，找到主峰后再缩）
正常结果应该出现两个清晰的峰：
- G1 峰：在通道值约 X 的位置（具体数值依电压而异）
- G2/M 峰：在约 2X 通道值位置（正好是 G1 的 2 倍荧光强度）
- S 期：两峰之间的连续分布
第 5 步：用 ModFit 或 FlowJo 拟合
直接用肉眼估 S 期会非常不准，必须用模型拟合。两种常用方法：
方法 A：FlowJo 内置 Cell Cycle 插件（快，但精度略低）
- 选中 DNA 直方图 → 右键 → Tools → Cell Cycle Analysis → Watson (Pragmatic) 或 Dean-Jett-Fox 模型
- FlowJo 会自动弹出拟合窗口，显示：
- G1 均值（Mean G1）
- G2/G1 比值（理想值 = 2.00）
- G1 CV 变异系数（<8% 为优秀，<15% 为合格）
- G0/G1 %、S %、G2/M %
- 点击 Apply，结果会写回到样本的 Stats 面板
方法 B：ModFit LT 软件（金标准，论文必备）
ModFit 是细胞周期领域专业软件，论文审稿人最认可：
- 将 FCS 文件从 FlowJo 中Export / Send To → ModFit LT（或直接在 ModFit 打开）
- 设置 PI 通道为分析参数
- 自动分析（Auto Analysis）：ModFit 会自动定位 G1/G2 峰、用高斯函数拟合
- 检查拟合曲线（红色细线）是否紧贴原始数据（灰色直方图）
- 输出结果报告
两种拟合模型的选择：
- Watson 模型：速度快、抗噪，适合初筛
- Dean-Jett-Fox / ModFit 的多高斯模型：拟合精度高，适合最终数据和投稿用
第 6 步：关键质量指标
拿到拟合报告后，先看质量指标，再看比例：
| 指标 | 合格标准 | 不合格意味着什么 |
|---|---|---|
| G1 CV | <8% 优秀，<15% 合格 | CV >20% → 染色有问题，峰型太差，结果不可信 |
| G2/G1 比值 | 1.90–2.10 | 偏差 >2.2 或 <1.8 → 电压/增益设置不当，或出现非整倍体 |
| Debris % | <5% | 碎片占比高 → 细胞收集损失大，可能 G2/M 比例偏低 |
| Aggregates % | <3% | 粘连体多 → 第 3 步设门不严格，重做单细胞门 |
| Chi-Square / RMS | 越小越好 | ModFit 中 RMS > 3 → 拟合质量差，手动调峰位重拟合 |
G1 CV 是最重要的质控指标。CV 太大的样品，S 期和 G2/M 会严重混合，比例完全没有意义。
常见异常峰形与原因
| 异常表现 | 可能原因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| G1 峰非常宽、矮胖，CV >20% | PI 浓度不够；RNase 没加或消化不足；乙醇固定时间不够 | PI 50 µg/mL 终浓度确认；RNase 100 µg/mL + 37°C 30 min；固定过夜 |
| G1 峰前面有一个凸起的亚 G1 峰 | 凋亡细胞（DNA 被切割成小片段，DNA 含量 <2n） | 这是正常现象，亚 G1 也可作为凋亡指标。拟合时在 Model 中勾选 “Include Apoptosis” |
| 没有 G2 峰，只有 G1 + 弥散 | 细胞被完全阻滞在 G1（如血清饥饿 48 h）；或 G2 细胞太少 | 这是真实生物学现象，不是技术问题。确认药物处理是否 G1 期阻滞 |
| 两个峰间距不是 1:2（G2/G1 ≠ 2） | 电压设置问题，通道线性范围不够；或细胞系本身多倍体 | 降低电压或改变增益，让 G1 峰在通道 1/3 位置，保证 G2 仍在线性范围；确认细胞系的倍性 |
| G1 峰出现分裂成两个峰 | 混杂了两种倍性的细胞系（比如传代细胞被污染）；或样品中混入了另一种细胞 | 重新确认细胞系身份；重新分群看是否可以把两群分开 |
| S 期区域出现离散小峰（梳子状） | 典型的多倍体/染色体异常细胞（肿瘤细胞系常见） | 不要强行用正常模型拟合，改用 Multi-cycle（多周期）模型；或说明该细胞系存在非整倍体 |
典型结果解读
正常对数生长期细胞
| Group | G0/G1 | S | G2/M |
|---|---|---|---|
| HeLa 正常培养 | 55% | 25% | 20% |
G1 比例最高，S 中等，G2/M 约为 G1 的 1/2~1/3。增殖指数 PI = (S + G2/M) ÷ Total ≈ 45%，属于正常增殖。
药物导致 G1 阻滞
| Group | G0/G1 | S | G2/M |
|---|---|---|---|
| Control | 58% | 22% | 20% |
| Drug 处理 24 h | 85% | 5% | 10% |
细胞大量堆积在 G0/G1，S 期骤降，说明药物抑制了 G1→S 转换（常见于 CDK4/6 抑制剂、血清饥饿）。
药物导致 G2/M 阻滞
| Group | G0/G1 | S | G2/M |
|---|---|---|---|
| Control | 55% | 25% | 20% |
| Nocodazole 12 h | 20% | 12% | 68% |
G2/M 比例大幅升高，说明药物抑制了 M 期退出（诺考达唑、紫杉醇等微管药物的典型效果）。
统计图与统计检验
- 统计图：堆积柱状图（Stacked Bar）最直观，X = 分组，Y = 百分比，每根柱按 G1/S/G2 分层上色
- 统计分析：对各期比例分别单独检验
- 两组比较：独立样本 t 检验
- 多组比较：One-way ANOVA + Dunnett/Tukey
- 注意：比例数据严格来说不是正态分布，但细胞周期结果（每组 n≥3）通常近似正态，可以直接用参数检验，审稿人一般接受
容易踩的坑
1. 把 Annexin V 凋亡管的数据直接拿过来做周期
绝对不要！Annexin V 染色通常用 Binding Buffer（低盐），会破坏细胞核完整性，而且 Annexin V 管的采集参数是按 Annexin/PI 双染设的（PI 通道增益通常更低，是测凋亡细胞膜破损的”亮染”，不是饱和 DNA 含量染色），完全不适合做周期分析。周期必须单独染色、单独采集。
2. 用 Log 坐标看周期图
DNA 含量是线性的（2n → 4n），用 Log 坐标会把 G1 和 G2 的比例关系压缩变形，必须切到 Linear 坐标。
3. 忽略单细胞门
G2 峰里会混入大量两个 G1 期细胞的粘连体，它们的荧光强度正好是 2×G1，无法区分。没有严格的单细胞门，G2/M 永远偏高。
4. RNase 失效
反复冻融的 RNase 酶活会下降，导致 RNA 残留，G1 峰变宽。RNase 原液分装后 −20°C 保存，避免反复冻融。配制好的 PI/RNase 工作液 4°C 保存，两周内用完。
相关实验拓展
- 与 Annexin V 凋亡双染结果联合分析：周期阻滞后是否伴随凋亡增加（可参考 Annexin V 凋亡实验阴性对照怎么做）
- 与 BrdU/EdU 掺入实验联合：EdU 能精确标记真正在 S 期进行 DNA 合成的细胞，比纯 PI 染色区分 S 期更准确
- 与 Western 验证结合：Cyclin D1/E/A、CDK4/6、p21、p53 等周期相关蛋白的表达变化，可支撑周期比例的结论