什么是 PCR 污染？
PCR 污染是指在 PCR 反应体系中混入了非目标 DNA，导致假阳性结果。PCR 极高的灵敏度既是优势也是劣势——即使是极少量的外源 DNA（理论上 1 个分子）也能被指数扩增，造成严重干扰。
污染的”定量影响”：
- 1 个携带 100 bp 扩增片段的 DNA 分子进入 20 μL qPCR 体系 = 约 35-38 Ct 的假阳性
- 如果进入 10 个分子 = 约 32-34 Ct
- 气溶胶中的 PCR 产物（10⁸ 分子/μL 级）只要 1 fL（10⁻¹⁵ L）就足以造成明显假阳性
所以一旦污染发生，Ct 通常分布在 35-40 这个”灰色区”，最容易和”低浓度真阳性”混淆。
污染的常见来源
| 来源类型 | 具体来源 | 占比估计 |
|---|---|---|
| 扩增产物污染 | 之前 PCR 产物气溶胶 | ~50% |
| 样本间交叉 | 移液器、耗材、离心管 | ~20% |
| 阳性对照污染 | 高浓度质粒或 PCR 产物 | ~15% |
| 试剂污染 | 酶、水、缓冲液 | ~8% |
| 操作者污染 | 手套、衣物、皮肤 | ~5% |
| 环境（工作台/空气） | 粉尘、气溶胶沉降 | ~2% |
预防措施
1. 分区操作原则
理想情况下，PCR 实验室应分为三个独立区域：
区域 1: 试剂配制区（正压）→ 放 PCR 柜 / 超净台 / 分装枪头 / 酶
↓ （物品单向流动，绝不回流）
区域 2: 样本处理区 → 样本 DNA/RNA 提取、加模板
↓
区域 3: 产物分析区（负压）→ 电泳、qPCR 读板、开 PCR 产物管每个区域专用设备：
- 移液器（不要共用！区域 1 的移液器绝对不能出现在区域 3）
- 迷你离心机
- 离心管架
- 手套盒
- 记录本
不要把”区域 3 刚用过的枪头盒”带回区域 1，不要用同一盒枪头跨区域。
简化版（空间不足的实验室）：
- 时间分区：上午做试剂配制 + 样本加样（开新板子），下午做产物分析 + 电泳
- 同一天先做”无污染端”再做”污染端”，做完产物分析后必须彻底清洁才能第二天做加样
2. 试剂配制规范
关键要点：
- 使用专用移液器，绝不与其他区域混用
- 试剂以小体积分装保存（10-20 次用量/管），用完即弃
- 酶在最后加入反应管（加完所有其他组分，最后加酶 + 盖管）
- 配制过程在超净台内完成，开紫外 + 风机 30 min 后再操作
分装清单（强烈建议执行）：
| 试剂 | 建议分装体积 | 保存温度 | 备注 |
|---|---|---|---|
| dNTP mix（10 mM） | 100 μL/管 | -20°C | 避免反复冻融 |
| 10× PCR Buffer | 500 μL/管 | -20°C | 含 Mg²⁺ 的要混匀再分装 |
| 引物 F/R（10 μM） | 50 μL/管 | -20°C | 引物原液和工作液分两管 |
| 灭菌 ddH₂O | 1.5 mL/管 | -20°C / 4°C | 小体积分装，不要用同一瓶加 3 个月 |
| Taq 酶 | 按每次用量 | -20°C | 酶不要反复冻融，拿出来全程冰上 |
3. 操作规范
| 操作 | 规范要求 |
|---|---|
| 移液 | 使用带滤芯的加长枪头，100% 用，绝不混用普通枪头 |
| 开盖 | 避免气溶胶产生：开盖前离心 30 s 收集液体，开时管口朝外、远离自己口鼻 |
| 离心 | 使用迷你离心机收集液体，不要震荡 PCR 管（震荡产生巨量气溶胶） |
| 手套 | 勤换，尤其在区域间移动时；摸过门把手、手机、笔后必须换 |
| 说话 | 操作台附近不要长时间交谈，打喷嚏/咳嗽必须离开 |
| 加样顺序 | 先加 H₂O → Buffer → dNTP → 引物 → 酶 → 最后加模板 |
加样时的”单向原则”：
- 永远从”最干净”的组分先加，最后加模板和阳性对照
- 加完每个组分后换一次枪头，不要”一把枪头加到底”
- 加模板时，先加 NTC（空白），再加待测样本，最后加阳性对照
4. 耗材选择
- 移液器枪头：带滤芯的一次性加长枪头，进口品牌更可靠
- PCR 管：使用薄壁管，出厂无菌无 DNase/RNase，不要重复使用
- 工作台：每次实验前用 DNA 去除剂（或 10% 漂白剂）擦拭，再紫外 30 min
- 清洁剂：10% 漂白剂（有效氯约 1%）或商业 DNA 去除剂（DNA AWAY、DNA ZAP 等）
PCR 操作台的”不要”：
- 不要放”开过的 PCR 产物管”在加样台上
- 不要放废纸、脏手套、离心管盖子
- 不要在同一台里既开产物管又做配液
- 不要把区域 3 的 Marker、琼脂糖、电泳缓冲液带进区域 1
污染检测与排查
阴性对照（NTC）检测
每次 PCR 必须包含阴性对照：
- NTC 出现扩增 = 存在污染
- 需要逐步排查污染源
NTC 是最灵敏的污染指标，不要省：
- 每板至少 2 个 NTC，分布在板的对角位置（监测移液器加样携带）
- 每 10 个样本加 1 个 NTC，如果 384 孔板至少放 4 个
排查步骤
- 更换所有试剂（水、酶、引物、dNTP 全换新批次）
- 更换移液器（全新或去污染过的）
- 更换耗材（枪头、PCR 管全拆新包装）
- 工作台深度清洁（漂白剂擦 → 水洗 → 紫外 60 min）
用对照矩阵精确定位：
| 对照 | 目的 | 出 Ct = 指向 |
|---|---|---|
| 只加 H₂O + 酶 + 引物 | 体系污染定位 | 水/酶/引物/耗材 |
| 对照 1 + 换全新 H₂O | 水 | 对照 1 有、此无 → 旧水污染 |
| 对照 1 + 换全新引物 | 引物 | 对照 1 有、此无 → 旧引物污染 |
| 对照 1 + 换全新酶 | 酶 | 对照 1 有、此无 → 旧酶污染 |
| 对照 1 + 去污染移液器 + 新枪头 | 移液器 | 对照 1 有、此无 → 移液器污染 |
| 对照 1 + 新房间（如细胞间） | 环境 | 对照 1 有、此无 → 环境污染 |
污染去除方案
方案一：化学处理
# DNA 去除液配方
0.1% 次氯酸钠（10% 漂白剂稀释 100×，注意不是 10×）
↓
擦拭所有表面：移液器外部、离心机内部、离心管架、冰箱门把手、操作台
↓
静置 10 分钟（不要立即擦掉，让次氯酸氧化 DNA）
↓
无菌水 / 75% 乙醇擦拭 2 次，去除残留次氯酸
↓
紫外照射（254 nm）30-60 min注意：
- 移液器内部也要处理：吸 1 mL 次氯酸钠 → 停留 30 s → 排掉 → 吸无菌水洗 3 次 → 自然晾干
- 次氯酸钠对金属有腐蚀，移液器不要长时间浸泡
- 漂白剂要新配（开封 <1 个月，否则有效氯下降）
方案二：紫外照射
- 照射波长：254 nm（265 nm 峰值的杀菌灯也 OK）
- 照射距离：30-50 cm，离紫外灯越近越好
- 照射时间：30-60 min（轻度 30 min，重度 120 min）
- 注意：被东西挡住的区域照不到，管架、移液器要翻面照，操作台也要移开东西后照
紫外的局限：
- 对高浓度质粒 (>10⁸ copies/μL) 喷雾污染，单独紫外不够，必须配合化学法
- 耗材内部（枪头盒里面）照不到，换新最可靠
最佳实践总结
- 分区操作：试剂配制与产物分析物理分离；空间不足就时间分区
- 专用设备：移液器、离心机、枪头盒按区域专用，贴标签区分
- 带滤芯枪头：防止移液器内部气溶胶扩散
- 勤换手套：每次开盖操作后、摸过非无菌物品后更换
- 阴性对照：每板必备，对角分布，2 个起
- 试剂分装：按 10-20 次用量分装，减少反复冻融和暴露
- 定期清洁：建立 PCR 区每周清洁规程（漂白+紫外+记录）
- 污染记录：每次发生污染做书面记录（日期、样本、引物、NTC Ct、最终定位原因），便于回头看趋势
延伸阅读：污染定位与分级清除、污染源定位实操、NTC 也有带的判断方法。
本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。