参数速查

🔬 Western blot 一抗二抗稀释参考表

Western blot 常见一抗、二抗的稀释比、稀释液、孵育条件与优化方向速查表。

在线计算

按字段标注的单位输入数值；序列类工具仅支持 `A / T / C / G`。

做 Western blot 时需要根据抗体类型选择合适的稀释比、稀释液和孵育条件，并在背景偏高或无信号时调整方案。本表覆盖内参抗体、磷酸化抗体、膜蛋白抗体以及 HRP/荧光标记二抗的常用稀释参数，适合在抗体试用初期或排查”无目的条带""背景脏”时直接查阅。

抗体类型	常用稀释比	稀释液	孵育条件	优化方向
一抗 · 内参 (anti-GAPDH/β-actin/Tubulin)	1:5000–1:10000	5% 脱脂奶粉 TBST	4 °C 过夜或 RT 1–2 h	信号过强时再稀释 2 倍；内参优先 RT 短孵育
一抗 · 目的蛋白 (常规)	1:1000	5% BSA TBST	4 °C 过夜	无信号先延长孵育，再考虑提高上样量
一抗 · 磷酸化抗体	1:500–1:1000	5% BSA TBST	4 °C 过夜	必须用 BSA，奶粉中磷酸酶会切磷酸基团
一抗 · 膜蛋白抗体	1:500–1:1000	5% BSA TBST	4 °C 过夜	不煮样品，37 °C 孵育有助于构象表位恢复
一抗 · 组蛋白修饰 (如 H3K4me3)	1:1000–1:2000	5% BSA TBST	4 °C 过夜	用 BSA；上样量不宜过大，避免内源竞争
一抗 · 单克隆 (高亲和)	1:1000–1:5000	5% BSA 或 5% 奶粉 TBST	4 °C 过夜	单抗特异性强，可适当提高稀释比降低背景
一抗 · 多克隆 (血清)	1:500–1:2000	5% BSA TBST	4 °C 过夜	多抗背景更杂，需更严苛的预吸附和洗涤
二抗 · HRP-抗兔/抗鼠 IgG	1:5000–1:10000	5% 脱脂奶粉 TBST	RT 1 h	稀释比过低会背景升高；二抗不要用 BSA
二抗 · HRP-抗山羊/抗鸡	1:5000–1:10000	5% 脱脂奶粉 TBST	RT 1 h	与一抗宿主对应；避免交叉反应
二抗 · 荧光标记 (IRDye/Alexa)	1:10000–1:20000	LI-COR Odyssey 缓冲液	RT 1 h，避光	荧光二抗不能用奶粉，含吐温会影响信号
二抗 · HRP-链霉亲和素 (SA-HRP)	1:10000–1:20000	5% BSA TBST	RT 30–60 min	生物素化一抗专用；避免牛奶中生物素干扰

表中稀释比为通用起点，实际最优值因抗体批次、厂商和抗原丰度而异；新抗体建议先按厂商说明书推荐范围做 1:500 / 1:1000 / 1:2000 三点梯度。
磷酸化抗体、糖基化抗体、乙酰化抗体等修饰类抗体必须用 5% BSA 稀释，不能脱脂奶粉——奶粉中含酪蛋白磷酸酶和免疫球蛋白会破坏修饰并升高背景。
一抗 4 °C 过夜通常比室温短孵育信噪比更高，但孵育时间过长也会让背景升高；目的蛋白丰度低时优先延长一抗，而不是无限加大上样量。
二抗稀释液一般用 5% 脱脂奶粉即可，但若一抗用 BSA，二抗也可继续用 BSA 以保持体系统一；荧光二抗严格按仪器厂商推荐缓冲液配制。
洗涤对背景影响很大：TBST 0.1% Tween-20，洗 3 次 ×5 min 是基线；背景偏高时增加到 5 次 ×5 min 或提高 Tween 到 0.15%。
内参抗体信号过强会压住目的条带，建议先单独跑一条内参通道，或在同一膜上用低丰度内参（如 Vinculin）替代 GAPDH。
上样量 20–40 μg 总蛋白为常规起点；膜蛋白、低丰度蛋白可加到 50–80 μg，但上样量过大会导致条带弥散和背景升高。

看抗体类型。常规内参和总蛋白抗体用 5% 脱脂奶粉即可，背景更干净；磷酸化、糖基化、乙酰化等修饰类抗体必须用 5% BSA，奶粉中的酶会破坏修饰基团。不建议在同一实验里混用——若一抗用 BSA、二抗切回奶粉，可能出现非预期背景。

丰度低、抗体亲和力弱、目的是检测低丰度蛋白 → 4 °C 过夜，背景更低、信号更聚焦。丰度高、抗体效价强、需要快速出结果 → RT 1–2 h，但通常要适当降低稀释比（即抗体浓度升高）以维持信号强度。磷酸化抗体不建议 RT 长时间孵育，磷酸酶活性会损失信号。

两者都要查。常见顺序：先确认封闭充分（5% 奶粉/BSA，RT 1 h）、洗膜充分（TBST 0.1%，3×5 min）；再考虑二抗是否过浓（HRP 二抗 1:5000 起步，不要 1:1000）；若上述都正常仍背景脏，再下调一抗稀释比。系统性排查可参考 Western 背景高的常见原因。

先调浓（即降低稀释比，1:1000 → 1:500），并延长一抗 4 °C 过夜。若仍无信号，问题大概率不在稀释比而在：转膜效率（小分子用 0.2 μm 膜，大分子延长时间）、抗原表位（煮沸破坏构象表位，膜蛋白改 37 °C）、上样量不足。可参考 Western 检测不到目的条带。

如果当前工具没有覆盖你的参数、样品类型或异常现象，可以把具体实验条件发过来，后续优先补成模板或排查页。