Western blot 没有蛋白信号怎么办

先看阳性对照和内参

如果目标蛋白无信号，但内参清晰，优先怀疑抗体识别、样品表达量或抗原暴露问题。
如果连内参都没有，则更应回到样品制备、转膜和显色体系本身。

无信号快速分流表：

四个最常见原因

1. 上样量不足或蛋白提取失败
2. 转膜效率低，蛋白没有真正转到膜上
3. 一抗或二抗失活、稀释倍数不合适
4. ECL 显色或曝光流程本身存在问题

1. 蛋白提取失败（30% 原因）

蛋白根本没提出来的典型信号：

• BCA/Bradford 定量测出来浓度 < 0.5 μg/μL（上清稀释后）
• 煮样后 Loading Buffer 颜色变透明（没染上蛋白），不是正常的深蓝
• SDS-PAGE 考马斯染色后胶上看不到带 / 非常浅
• 内参也完全没信号（Actin 60 μg 上样量都看不到）

提取失败的常见原因：

最佳蛋白提取 SOP：

• 6 孔板/细胞瓶：用 PBS 洗 2 次，吸干最后一滴 PBS → 加 RIPA → 刮 → 移至 EP 管 → 4°C 孵育 30 min → 离心取上清 → 定量 → 加 loading buffer → 煮样 5 min
• 组织样本：液氮研磨成粉末 → 按 100 mg : 500 μL 加 RIPA → 冰浴超声 20 s × 3 次（间隔 30 s）→ 离心取上清

2. 转膜问题（25% 原因）

验证转膜是否成功（每次都要做的质控！）： 转膜完成后，立刻用丽春红 S（Ponceau S）染膜 5 min：

• 如果丽春红看到清晰的条带梯度（Marker 处也有）→ 转膜 OK
• 如果丽春红一条带都没有 → 转膜完全失败，后面不用孵抗体了

转膜失败的常见错误：

3. 抗体体系问题（25% 原因）

一抗问题分类：

• 失活的一抗：反复冻融 >3 次、4°C 放了 >6 个月、-20°C 放了 >2 年
• 稀释倍数不对：按说明书 1:1000 做实际要 1:200 才出带（说明书是“通用条件”不是“你这个样本的最优条件”）
• 孵育时间短：4°C <8 h 孵育对于低丰度蛋白通常不够（建议 4°C 过夜，12-16 h 是最优区间）
• 抗原决定簇被掩盖（最容易忽略）：某些抗体只能识别天然蛋白，WB 是变性条件，识别不了 → 要看说明书上有没有 “Applications: WB” 这一栏！

二抗问题：

• 种属错了：一抗是 Rabbit IgG，二抗用了 anti-Mouse → 完全不结合
• HRP 失活：二抗反复冻融 / 4°C 放了 >3 个月 / 叠氮钠污染会完全抑制 HRP
• 浓度不对：稀释 1:10000 太稀 → 信号弱；但稀释过浓又会有背景

抗体孵育的最优条件（新手照着调）：

• 一抗：推荐稀释比做预实验 3 个梯度（1:200、1:1000、1:5000），4°C 摇床缓慢摇动过夜
• 封闭：5% 脱脂奶粉/TBST，室温 1 h（或 4°C 过夜）
• 洗膜：TBST 每次 5 min × 3 次，一抗后二抗后都要洗
• 二抗：1:5000 ~ 1:10000（HRP 结合的），室温 1 h

4. ECL 显色 / 曝光问题（20% 原因）

ECL 底物失效判断：

• 拿一点 A 液 + B 液混合 → 加一点已知有 HRP 的废弃二抗 → 如果不发光 = 底物 100% 失效
• 新拆封的 ECL 一般 4°C 有效期 3-6 个月（看说明书），SuperSignal Femto 这种灵敏度高的只有 1-3 个月
• 不要和别人共用 ECL，滴加在膜上的 A/B 液不要回吸到瓶子里（交叉污染会整瓶坏掉）

曝光参数问题：

• 用普通 ECL（灵敏度 ng 级）时，曝光 30 s ~ 5 min 合适
• 用超敏 ECL（pg 级）时，曝光 5 s ~ 30 s，太长会过曝成一片黑
• 如果用凝胶成像仪的化学发光档，需要选对拍摄模式（不要选 UV 模式！不要选 EB 模式！）
• 如果用暗室胶片：
  • 显影液/定影液配置对不对？放久了会失效
  • 压片时间从 10 s、1 min、5 min、30 min 梯度试
  • 胶片完全变黑 = 显影液过热/时间太长
  • 胶片完全没东西 = 没压好/曝光时间太短/没信号

建议排查顺序

先确认样品总蛋白和上样量，再看转膜后是否做过 Ponceau 或其它快速染色。
如果转膜正常，再回头检查抗体保存、稀释液和孵育时间。
最后再检查显色底物是否失效以及曝光窗口是否合适。

推荐系统性排查顺序（一步一对照，6 步必出原因）：

1. 阳性对照 + 内参泳道：每块胶必须有 1 个孔是已知阳性样本（过表达细胞裂解液或该抗体的推荐阳性对照）+ 只加 Loading Buffer 的空白孔
2. 转膜丽春红验证：丽春红没看到带 → 直接停，转膜/样品有问题
3. 考马斯亮蓝染跑过蛋白后的胶：如果胶上还留着大量蛋白 → 转膜不充分；如果胶也没蛋白 → 提取失败
4. 抗体互换验证：用一支你 100% 确定有效的旧抗体 + 同一张膜孵育；如果出带 → 原抗体坏了；如果还是没带 → 样品/转膜问题
5. 棋盘滴定：一抗 × 二抗做 3×3 浓度矩阵（1:200/1:1000/1:5000 × 1:2000/1:10000/1:50000），找最优组合
6. 换新 ECL 底物 + 新二抗 + 新曝光方法（不要用之前的任何试剂，从拆封开始）

常见修正动作

• 适当提高上样量，但避免一口气加太多。
• 缩短封闭时间或更换更适合的封闭体系。
• 用已知有效样品验证一抗。
• 重新配置新鲜显色底物并缩短操作间隔。

优化上样量的经验：

• 管家基因（Actin、GAPDH、Tubulin）：10-30 μg 总蛋白足够
• 高丰度表达的胞质蛋白：20-40 μg
• 中等丰度膜蛋白/核蛋白：50-80 μg
• 低丰度蛋白（磷酸化蛋白、细胞因子、转录因子）：80-120 μg + 用超敏 ECL 底物（Femto 级）
• 上样 >80 μg 时必须小心：内参会过曝，背景会高，建议同时做 3 个上样梯度（20/50/100 μg）

封闭体系选择：

延伸阅读：WB 条带弱怎么办、WB 样品制备标准化流程、转膜与封闭条件核查。