为什么明明”有表达”却还是拿不到蛋白
做过原核表达的同学几乎都踩过这个坑：SDS-PAGE 显示诱导后有一条又粗又亮的目标条带，大小也对，高高兴兴超声破菌后取上清和沉淀对比——目标蛋白 100% 在沉淀里，上清几乎没有。这就是蛋白全部形成了包涵体（inclusion bodies）。
已有文章 bacterial-protein-no-expression 解决的是”完全不表达”的问题，inclusion-body-refolding-failure 解决的是”既成包涵体后怎么复性”的问题。本文聚焦中间最关键的一环：在表达过程中主动预防包涵体形成，尽量把蛋白留在可溶性上清里。毕竟，能直接纯化可溶蛋白，远比变性再复性靠谱得多、快得多。
优化前的准备：先做一次”基线诊断”
在盲目改条件之前，先做一个4 管小量诊断实验，用 5 mL 体系（2×YT 培养基、37°C、OD600=0.6、IPTG 1 mM、诱导 4 h）分别取：
| 样品 | 怎么取 | 看什么 |
|---|---|---|
| ① 未诱导全菌 | 诱导前取 1 mL | 确认条带确实是诱导后出现的（不是漏表达） |
| ② 诱导后全菌 | 4 h 后取 1 mL | 确认”确实有表达”，目标蛋白占比约多少 |
| ③ 超声上清（可溶组分） | 菌体超声裂解后 12 000 g × 10 min 取上清 | 目标蛋白在不在？灰度大概占全菌的百分之几 |
| ④ 超声沉淀（包涵体组分） | 沉淀用 8 M 尿素或 1× Loading 煮沸溶解 | 目标蛋白是否全部在这里 |
根据 ③ 和 ④ 的比例，可以快速定位优化空间：
| 可溶 / 沉淀比例 | 场景判断 | 优化优先级 |
|---|---|---|
| < 5% / > 95% | 经典”全包涵体” | 全维度优化，先调温度+IPTG |
| 10–30% / 70–90% | 部分可溶、部分包涵 | 微调温度+标签+补料即可翻倍 |
| > 50% / < 50% | 已较可溶，只需纯化放大 | 优化扩大培养，不需要大改条件 |
灰度定量技巧：用 ImageJ 打开条带，Analyze → Gels → Select lanes 选 ③ 和 ② 的目标条带，算比值。可参考 imagej-western-blot-quantification 的方法。
维度一：诱导温度——影响最大、成本为零的单因素
温度是决定可溶性表达的第一因素。高温（37°C）蛋白合成速率快，折叠机器（分子伴侣）跟不上，未折叠的疏水区域暴露就聚集形成包涵体。
温度梯度优化方案（推荐第一次就做 4 点）
准备 4 管 10 mL 同样的菌液，在 OD600=0.5–0.6 时，分别放到以下温度的摇床，统一 IPTG 0.2 mM、诱导 16 h（过夜）：
| 温度 | 典型效果 | 适用场景 |
|---|---|---|
| 37°C | 表达量最高，但极容易全包涵 | 已知很稳定的报告蛋白（GST、MBP 单独）；或者准备走变性纯化路线 |
| 30°C | 表达量约 37°C 的 70%，可溶比例显著上升 | 大多数蛋白的”折中试金石”，第一次优化必做 |
| 25°C（室温附近） | 表达量约 50%，可溶比例通常最高 | 膜蛋白、酶、蛋白-蛋白复合物等难溶蛋白 |
| 16–18°C | 表达量低（约 30%），但可溶性极好、折叠最正确 | 酶活敏感蛋白、晶体学样品；配合冷室摇床 |
| 4°C 超低温诱导 | 几乎不生长但仍能缓慢表达（2–3 天） | 某些极度难溶蛋白最后的手段；需配合 T7 RNA 聚合酶启动子或低温专用宿主菌 |
操作细节：
- 降温诱导时，提前把摇床温度调好，把菌液瓶放进去预冷 10–15 min 再加 IPTG，不要加完 IPTG 才挪过去
- 低温诱导延长时间到 16–20 h，保证积累量
- 诱导后收菌时用 4°C 离心，菌体沉淀可 −20°C 冻存到第二天纯化
维度二：IPTG 浓度与诱导时机——别一上来就 1 mM 拉满
IPTG 是乳糖类似物，不可逆诱导 lac 启动子。IPTG 浓度过高本身就是细胞毒性应激，细胞一应激就容易产生包涵体。
IPTG 浓度梯度（和温度一起做成矩阵最好）
| IPTG 终浓度 | 效果 | 推荐场景 |
|---|---|---|
| 0.05–0.1 mM | 极弱诱导，蛋白合成慢，可溶比例最高 | 与 16°C 配合，用于极度难溶蛋白 |
| 0.2–0.4 mM（黄金区间） | 中等诱导强度，表达量/可溶比均衡 | 绝大多数优化，建议默认起点 0.2 mM |
| 0.5–1 mM | 强诱导，表达量高但易包涵 | 37°C 短时间诱导、走变性纯化路线时用 |
| 乳糖替代（0.5–1% w/v） | 温和缓慢诱导，持续时间长 | 工业放大常用；对 IPTG 敏感的表达（如毒性蛋白）更友好 |
诱导时机（OD600 什么时候加 IPTG）
| OD600 区间 | 菌态 | 推荐用法 |
|---|---|---|
| 0.4–0.6（对数早期） | 细胞代谢最旺盛，个体差异最小 | 大多数可溶性优化的首选 |
| 0.6–0.8（对数中期） | 细胞密度更高 | 表达量稳定时可选用，能拿到稍多菌体 |
| > 1.0（对数晚期/平台期） | 营养开始耗尽，部分细胞进入稳态 | 不推荐，平台期加 IPTG 极易形成包涵体 |
关键口诀：“低温度 + 低 IPTG + 长时间”是可溶性三件套，三个因素叠加效果远好于只调一个。
维度三：培养基与补料——给细胞”吃得好”才能折叠好
营养匮乏时，细胞把能量优先用在分裂和存活上，蛋白折叠机器（DnaK/DnaJ/ GroEL/GroES 分子伴侣系统）供应不足，新合成的蛋白就容易沉淀。
培养基选择对比
| 培养基 | 特点 | 可溶性表达表现 |
|---|---|---|
| LB（Luria-Bertani） | 最常用，蛋白胨+酵母粉+盐 | 基础水平，对简单蛋白够用 |
| 2×YT / SB（Super Broth） | 蛋白胨和酵母粉含量翻倍 | 推荐，营养更丰富，支持更高密度，可溶性更好 |
| TB（Terrific Broth） | 加甘油（碳源）+ 磷酸缓冲液（稳 pH） | 高密度培养首选，菌体产量比 LB 高 2–3 倍，蛋白绝对产量更高 |
| M9 / 合成培养基 | 成分明确 | 一般不用来做可溶性优化，仅用于同位素标记（NMR / Selenium-Met） |
TB 配方（1 L）速查：
- 蛋白胨 12 g
- 酵母提取物 24 g
- 甘油 4 mL
- 高压灭菌后冷却到 60°C 以下，加入 100 mL 单独灭菌的 0.17 M KH2PO4 / 0.72 M K2HPO4 磷酸盐储液
- 使用前加入对应抗生素
诱导时补料策略（进阶）
长时间诱导（> 12 h）的培养基容易被耗尽，可以在加 IPTG 的同时补一点营养：
| 补料成分 | 终浓度 | 作用 |
|---|---|---|
| 葡萄糖 | 0.5–1% | 补充碳源，延缓营养枯竭（但注意：葡萄糖会抑制 lacUV5，对 T7 启动子影响不大） |
| 1 M MgSO4 | 1–2 mM | 稳定核糖体、激活多种代谢酶 |
| 100× 金属离子混合液 | 1× | 提供 Mn、Fe、Zn 等，对金属蛋白尤其关键 |
| 山梨醇 + 甜菜碱 | 0.5 M + 5 mM | 渗透压稳定剂，对膜蛋白和聚集倾向蛋白有奇效 |
维度四：融合标签——给蛋白”套一件 solubility 外衣”
标签不仅是纯化用的钩子，很多标签本身就具备促溶功能。如果目标蛋白本身天然就容易聚集，换一个大一点的促溶标签往往立竿见影。
常用融合标签的促溶能力对比
| 标签 | 大小 | 促溶能力 | 切标签难度 | 典型适用 |
|---|---|---|---|---|
| His6× (His-tag) | ~0.8 kDa | ⭐ 弱（几乎不促溶） | 不需要切（通常直接保留） | 已知比较可溶的球状蛋白 |
| GST (Glutathione S-transferase) | 26 kDa | ⭐⭐ 中等 | 用 PreScission / Thrombin / Factor Xa，位点特异 | 中等难度蛋白，GST 二聚体有助于提升表观溶解度 |
| MBP (Maltose-Binding Protein) | 42 kDa | ⭐⭐⭐⭐ 最强促溶标签 | 用 TEV / Enterokinase / Factor Xa 切割 | 首选：已知易包涵的蛋白；毒性蛋白（MBP 能遮蔽毒性） |
| NusA | 55 kDa | ⭐⭐⭐⭐ 强促溶 | 需设计酶切位点 | 大分子量伴侣式助折叠，对小蛋白效果尤其好 |
| Trx (Thioredoxin) | 12 kDa | ⭐⭐ 轻促溶 | 用 TEV / Enterokinase | 分子量小，对二硫键丰富蛋白更友好（Trx 本身有二硫键异构酶活性） |
| SUMO | 12 kDa | ⭐⭐⭐ 较好 | 用 Ulp1 / SENP 蛋白酶，特异性最高，切点干净 | 真核来源蛋白常用；切完无多余氨基酸残留 |
决策建议：
- 如果 His-tag 小量表达已经有 > 20% 可溶，就保留 His-tag，不用换
- 如果 His-tag 完全不溶（< 5%），优先并行构建 MBP-His 双标签（MBP 在前、His 在 C 端或 MBP 和目标之间留 TEV 位点）
- 对二硫键丰富的分泌型蛋白，Trx 标签 + Origami B（二硫键通路缺陷型）宿主菌组合效果最好
维度五：宿主菌株——匹配表达需求
不同的 BL21 衍生菌株缺失了不同的蛋白酶、补充了不同的分子伴侣，选择匹配的菌株能显著提升可溶性。
| 菌株 | 关键基因型 | 适用场景 |
|---|---|---|
| BL21(DE3) | lon− ompT− DE3（含 T7 RNAP） | 最基础的通用菌株，所有实验的起点 |
| BL21 Star(DE3) | 同上 + rne131（RNase E 缺陷） | mRNA 不稳定的长 ORF、低表达蛋白 |
| BL21(DE3)pLysS / pLysE | 含 pLys 质粒（低水平表达 T7 溶菌酶抑制漏表达） | 基础毒性蛋白、未诱导状态漏表达严重的质粒 |
| Rosetta(DE3) | BL21 + 补充 7 种稀有密码子 tRNA（AUA/AGG/AGA/CUA/CCC/GGA/UGG） | 真核来源蛋白首选，密码子偏性是”看似不溶其实翻译不完整”的隐形原因 |
| Shuffle T7 / Origami B(DE3) | trxB− gor−（细胞质二硫键形成通路缺陷修复） | 含多对二硫键的分泌蛋白、IgG 结构域、生长因子等 |
| BL21(DE3) + pGro7（GroEL/GroES 共表达） | 额外过表达 GroEL/GroES 分子伴侣 | 对分子伴侣依赖强的大蛋白、复合物亚基 |
| BL21(DE3) + pKJE7（DnaK-DnaJ-GrpE + GroEL-GroES） | 全套主要分子伴侣共表达 | 以上方法都不奏效时的”终极武器”，成功率高但需要额外加 L-阿拉伯糖诱导 |
常见坑：
- 做真核蛋白却直接用 BL21(DE3)，稀有密码子导致翻译提前终止，跑出来的条带比 Marker 小，而且”看似全在沉淀”——实际是翻译不完整的片段聚集。换成 Rosetta 往往立刻变好
- 含二硫键的蛋白用普通 BL21 做细胞质表达，即便可溶也没活性（二硫键乱配）。用 Origami/Shuffle 菌株或者换周质空间表达（带 pelB 信号肽）
维度六：分子伴侣与添加剂——最后的进阶手段
如果以上 5 个维度都调过，溶解度仍然 < 10%，可以尝试以下手段：
分子伴侣质粒共表达
| 质粒 | 表达的分子伴侣 | 诱导剂 | 备注 |
|---|---|---|---|
| pGro7 | GroEL + GroES | L-阿拉伯糖 0.5 mg/mL | 对 30–60 kDa 球状蛋白最有效 |
| pKJE7 | DnaK-DnaJ-GrpE + GroEL-GroES | L-阿拉伯糖 0.5 mg/mL | 广谱，大蛋白也适用 |
| pTf16 | Trigger Factor | L-阿拉伯糖 | 共翻译折叠辅助，对新生肽链聚集有效 |
| pG-Tf2 | GroEL + Trigger Factor | 四环素 5 ng/mL |
操作要点：
- 分子伴侣质粒通常带氯霉素抗性（34 µg/mL），和 Amp/Kan 质粒不冲突
- 先诱导分子伴侣 30–60 min，再加 IPTG 诱导目标蛋白，顺序不能反
- 温度用 25°C 或更低，让分子伴侣有足够时间发挥作用
培养基中直接添加小分子促溶剂
| 添加剂 | 终浓度范围 | 作用 |
|---|---|---|
| 山梨醇（Sorbitol） | 0.3–0.5 M | 渗透压力稳定剂，减少疏水相互作用 |
| 甘氨酸甜菜碱（Betaine） | 1–5 mM | 配合山梨醇使用，协同提升溶解度 |
| 乙醇 | 1–3% v/v | 轻度热休克应答，诱导内源性分子伴侣上调 |
| NaCl 高盐 | 0.4–0.8 M | 对电荷相互作用介导的聚集有效 |
| 精氨酸盐酸盐（L-Arginine·HCl） | 0.2–0.5 M | 经典的蛋白聚集抑制剂，纯化缓冲液也用 |
注意：以上添加剂必须在破菌后的裂解缓冲液里也要保留相同浓度，否则细胞一破，蛋白失去了培养基里的稳定环境，又会瞬间聚集。
一张决策流程图总结
蛋白表达但全在沉淀
│
├─ 先做 4 管诊断：37°C/30°C/25°C/16°C × IPTG 0.2 mM → 找温度趋势
│
├─ 如果低温可溶比例 > 10%
│ ├─ 固定该温度，做 IPTG 0.05/0.2/0.5 mM 梯度
│ ├─ 培养基换成 2×YT 或 TB
│ └─ 通常就能做到 30–50% 可溶
│
├─ 如果低温 + 低 IPTG 仍然 < 10% 可溶
│ ├─ 换标签：His → MBP 或 NusA
│ ├─ 换菌株：BL21 → Rosetta 或 Origami B（视密码子/二硫键情况）
│ └─ 加分子伴侣质粒或山梨醇+甜菜碱
│
└─ 如果以上全部失败（< 2%）
├─ 评估是否走包涵体变性纯化 + 复性路线（参考 inclusion-body-refolding-failure）
└─ 考虑换表达系统：酵母（Pichia pastoris）、昆虫细胞、哺乳动物细胞常见踩坑总结
坑 1：温度只改了 37→30，摇床转速也跟着降了
温度实验必须保持摇床转速一致（通常 220–250 rpm）。转速变了溶氧就变，你无法区分是温度还是溶氧的影响。
坑 2：低温诱导时间还按 37°C 的 4 h 来收
温度越低，需要的诱导时间越长。16°C 通常要 16–20 h 过夜，25°C 也要 10–12 h，别按 4 h 就收，蛋白还没积累起来。
坑 3：测可溶性的超声步骤太暴力，蛋白被剪切力弄坏了
超声功率过大、探头太浅产生泡沫，都会让本来可溶的蛋白发生变性聚集。标准操作：
- 菌体重悬比例：1 g 湿菌（约 50 mL 菌液收的）加 5–10 mL 裂解缓冲液
- 超声：200–300 W，开 3 s、停 5 s，总时间 5–10 min
- 判断标准：菌液从乳浊变清亮，粘度下降；不要等到起泡
坑 4：标签 MBP 极大促进溶解，但 TEV 切完又沉淀了
MBP 提升了表观溶解度，不代表目标蛋白本身折叠对了。切标签后沉淀是常见情况。处理：
- 切标签在 4°C 下进行，反应稀释到蛋白浓度 < 1 mg/mL
- 切完后 12 000 g × 10 min 取上清过柱，不要直接全部上样
- 可考虑保留部分 MBP（只用一部分酶切，找到一个”足够纯且溶解”的平衡点）
典型成功案例参考
| 目标蛋白类型 | 初始条件 | 优化后条件 | 可溶比例变化 |
|---|---|---|---|
| 人类激酶结构域（35 kDa） | BL21 / 37°C / 1 mM IPTG / 4h / His | Rosetta / 16°C / 0.2 mM IPTG / 18h / MBP-His | < 5% → 45% |
| 真核二硫键丰富细胞因子（18 kDa） | BL21 / 37°C / LB | Shuffle T7 / 25°C / TB + Trx-His | 0% → 30%（且恢复活性） |
| 膜蛋白胞内结构域（50 kDa） | BL21 / 30°C / 1 mM / His | BL21 + pGro7 / 18°C / 0.1 mM / TB + 山梨醇+甜菜碱 | < 3% → 20% |
| 植物来源蛋白（密码子偏性强） | BL21 / 37°C / His | Rosetta / 16°C / 0.2 mM / MBP-His | 条带偏小分子量异常 → 正常分子量 + 35% 可溶 |
按以上 6 个维度系统优化，绝大多数蛋白都能把可溶性提升到可纯化水平。只要拿到了 10% 以上的可溶比例，剩下的就是纯化放大和优化了——那就是另一个故事了。