概述
Western blot 是检测目标蛋白表达水平的标准方法，但单纯”看条带”只能定性判断。要做组间比较、统计学分析或发表文章，必须对条带进行灰度定量。ImageJ/FIJI 是 NIH 开发的免费开源图像分析软件，被生命科学领域广泛使用，其”Gel Analyzer”工具专为 Western blot 条带定量设计，可以测量条带灰度积分值并生成峰图，配合内参（如 β-actin、GAPDH）归一化即可计算相对蛋白表达量。
本指南适用于化学发光（ECL）曝光图像的灰度定量，不适用于荧光 Western（如 LI-COR Odyssey）图像——后者需用配套软件直接读取荧光强度。
软件准备
- 访问 FIJI 官网（https://imagej.net/software/fiji/）下载对应操作系统的版本
- FIJI 是 ImageJ 的发行版，预装了常用插件，推荐使用
- 解压后将 FIJI.app 文件夹拖入 Applications（Mac）或 Program Files（Windows）
- 首次启动时会自动检查更新，建议更新到最新版本
操作步骤
步骤一：导入图片
File → Open 选择 Western blot 曝光图像（推荐 TIFF 或 PNG 格式，避免 JPEG 压缩伪影）。
步骤二：转为 8-bit 灰度图
Image → Type → 8-bit。如果图像是彩色的，先转灰度；如果是 16-bit，转 8-bit 以便后续处理。
步骤三：框选条带区域
使用 Rectangular 工具（快捷键 m），框选整条泳道（包含上下所有目标条带和内参条带，避开 marker）。注意每个泳道单独分析一次，保证背景区域一致。
步骤四：启动 Gel Analyzer
Analyze → Gels：
- 选择
Select First Lane（或按数字键1）——此时框选区域会出现”1”标记 - 用鼠标将矩形框拖到下一个泳道（保持大小一致），按数字键
2或Analyze → Gels → Select Next Lane - 重复至所有泳道都标记完（编号 1、2、3…）
步骤五：绘制峰图
按数字键 3 或 Analyze → Gels → Plot Lanes。软件会为每个泳道生成一个峰图窗口（横轴为距离，纵轴为灰度值）。
步骤六：峰分割与测量
- 用直线工具（
l）在每个峰的谷底画垂直线，将相邻峰分开 - 用魔棒工具（
w）依次点击每个峰，软件自动计算峰面积（即条带灰度积分值） - 结果会出现在 Results 窗口中，Area 列即为各条带的灰度值
步骤七：内参归一化
在 Excel 中：
- 目标蛋白灰度值 ÷ 同泳道内参灰度值 = 归一化值
- 实验组归一化值 ÷ 对照组归一化值 = 相对表达量
结果导出
在 Results 窗口中：
File → Save As，选择 .csv 格式- 用 Excel 打开 CSV 文件，按泳道和条带整理
- 计算”目的蛋白 / 内参”比值
- 多次重复实验取平均值 ± 标准差，用 GraphPad Prism 或 Excel 绘制柱状图
常见问题
背景扣除
如果条带周围有非特异背景，需在峰图中将直线画在背景基线位置，让软件扣除背景。也可以在分析前用 Process → Subtract Background（滚动球半径设为 50 像素）预处理。
图片格式要求
只接受未压缩的 TIFF/PNG 格式。JPEG 会引入块状伪影，导致定量不准。原始化学发光图像应直接从化学发光成像系统（如 Bio-Rad ChemiDoc、Tanon 5200）导出 TIFF。
条带饱和
如果曝光过度，条带中心像素达到最大值（8-bit 为 255），定量会偏低。应在采集时避免饱和，可用 Analyze → Histogram 检查像素分布是否触顶。
注意事项
- 图片分辨率：建议 ≥300 dpi，像素过少会导致峰分割不准
- 未压缩原始图片：从化学发光仪导出时不要经过 PowerPoint 或 Word，这些软件会压缩图片并改变像素值
- 曝光时间一致：同一批次比较的图片必须用相同曝光时间采集
- 线性范围验证：上样量过大可能超出检测线性范围，建议做 1×、1/2×、1/4× 梯度验证线性
- 避免多次处理：同一图像反复调整亮度/对比度会改变灰度值，所有调整仅在分析前做一次
- 内参选择：内参条带灰度应与目标条带灰度在同一数量级，避免高丰度内参掩盖低丰度目标
延伸阅读：Western blot 条带弱、Western blot 背景高、ImageJ 细胞计数操作指南、ImageJ 荧光图片分析。