问题现象
CRISPR 实验进入检测阶段后，常见以下三类低效率表现：
- T7E1 酶切法：切割条带很弱或完全看不到，酶切效率 <10%
- Sanger 测序：靶位点峰图从突变点附近开始套峰，但套峰高度明显低于主峰
- 单克隆测序 / NGS：阳性克隆比例低（<30%），或 indel 以 1 bp 插入缺失为主、敲除效果差
编辑效率低不等于实验完全失败，但会显著增加后续筛选单克隆的工作量。先按以下四个维度定位原因，再针对性优化。
第一步：确认 sgRNA 本身活性
sgRNA 质量是编辑效率的最大变量。同一个基因的不同 sgRNA，效率可能相差 10-100 倍。
1.1 优先使用效率预测评分高的 sgRNA
| 预测工具 | 评分规则 | 建议阈值 |
|---|---|---|
| Doench 2016 (Rule Set 2) | 0-100，分数越高切割效率越高 | ≥60 可尝试，≥70 较优 |
| Azimuth | 针对人类细胞优化 | ≥0.6 可尝试，≥0.7 较优 |
| CRISPOR 效率评分 | 综合多种算法 | 前 20% 的 sgRNA 优先 |
| S. pyogenes Cas9 评分 | 基于体外切割数据 | 中高评分即可 |
避坑建议：不要只看一个工具的分数。建议用 CRISPOR 或 Benchling 同时看 Doench、Azimuth、SSC 三个评分，取交集。
1.2 检查 sgRNA 的基本参数
| 参数 | 理想范围 | 偏离后的风险 |
|---|---|---|
| GC 含量 | 40%-60% | <35% 结合弱，>65% 易形成二级结构 |
| 长度 | 20 nt（不含 PAM） | 17-18 nt 可降低脱靶但效率可能下降 |
| PAM | NGG（SpCas9） | PAM 识别错误会完全无切割 |
| 靶向外显子位置 | 编码区前 1/3 | 靠近末端的 indel 不易产生移码 |
| 自身二级结构 | ΔG > -30 kcal/mol | 强发夹结构会阻碍与 Cas9 结合 |
1.3 同一基因设计 2-3 条 sgRNA 并行测试
不要只测一条 sgRNA。建议至少测试 2-3 条，用 T7E1 或测序快速比较，挑选效率最高的一条做后续实验。
快速筛选流程：
- 转染后 48-72 h 收细胞
- 提取基因组 DNA，PCR 扩增靶位点（产物 300-800 bp）
- T7E1 酶切 30-60 min，跑胶定量
- 选择切割效率 ≥30% 的 sgRNA 进入下一步
第二步：检查递送系统
即使 sgRNA 很好，递送失败也会导致编辑效率低。
2.1 质粒转染：先确认转染效率
| 转染方式 | 适用细胞 | 编辑效率关键 |
|---|---|---|
| 脂质体 | 贴壁细胞系 | 细胞密度 60%-80%，质粒质量高 |
| 电转 / 核转 | 难转染细胞、原代细胞 | 电压和脉冲优化，细胞活率 >90% |
| 慢病毒 | 难转染、需稳定表达 | MOI 和 Polybrene 浓度 |
| RNP（核糖核蛋白） | 原代细胞、干细胞 | Cas9 蛋白和 sgRNA 比例 |
必须做的对照：共转一个 GFP 对照质粒，荧光显微镜或流式确认转染效率。
- 转染效率 <30%：先优化转染条件，不要直接测编辑效率
- 转染效率 30%-50%：可以检测到编辑，但阳性信号会被稀释
- 转染效率 >70%：编辑效率低才更有可能是 sgRNA 或检测问题
2.2 Cas9 和 sgRNA 表达框检查
| 检查项 | 常见问题 | 验证方法 |
|---|---|---|
| Cas9 表达 | 启动子不合适、Cas9 太大导致表达弱 | Western blot 检测 Cas9 蛋白 |
| sgRNA 表达 | U6 启动子下游第一个碱基不是 G | 测序验证 sgRNA 载体 |
| 骨架选择 | px330/px458 等骨架效率差异 | 换用 px459、LentiCRISPR v2 等验证 |
| 抗生素筛选 | 抗性基因未表达导致阳性细胞丢失 | kill curve 验证抗性浓度 |
2.3 RNP 体系优化
RNP 是目前编辑原代细胞和干细胞效率较高的方式，但比例很关键：
- Cas9 蛋白 : sgRNA 摩尔比：通常 1:1.2-1:1.5
- sgRNA 浓度：10-50 pmol / 10^5 细胞
- 电转后恢复：37°C 恢复 48-72 h 再检测，避免细胞应激期假阴性
第三步：排查细胞状态
3.1 细胞类型本身的编辑难度差异
| 细胞类型 | 常见效率 | 优化方向 |
|---|---|---|
| HEK293T / HeLa | 50%-90% | 常规质粒转染即可 |
| HCT116 / U2OS | 30%-70% | 优化转染试剂 |
| 原代细胞 | 5%-30% | 推荐 RNP 或慢病毒 |
| iPSC / ESC | 10%-40% | RNP + 优化电转参数 |
| 免疫细胞（T 细胞） | 5%-25% | 电转 RNP，优化缓冲液 |
3.2 细胞状态不佳会显著降低编辑效率
- 支原体污染：必须排除，支原体阳性细胞的编辑效率可能下降 50% 以上
- 细胞老化：连续传代 >30 代的细胞系，DNA 修复能力下降
- 转染后应激：电转或脂质体毒性导致大量细胞死亡，活下来的细胞编辑效率被低估
- 细胞周期：Cas9 切割后依赖 NHEJ 或 HDR，不同细胞周期效率不同
建议：转染前检测支原体，使用对数生长期细胞，电转后 6 h 换液降低毒性。
第四步：优化检测方法
4.1 T7E1 酶切法的常见误判
T7E1 只能识别异源双链，编辑效率会被低估。
| 情况 | 对 T7E1 结果的影响 | 处理建议 |
|---|---|---|
| 纯合敲除 | 无杂合双链，T7E1 切不出条带 | 用测序或 NGS 验证 |
| 编辑比例 <5% | 切割条带很弱，可能看不到 | 提高 PCR 循环数，或换高灵敏度方法 |
| PCR 产物不纯 | 非特异条带干扰判读 | 胶回收或优化 PCR 条件 |
| 酶切不完全 | 切割条带弱 | 延长酶切时间至 60 min |
4.2 更准确的定量方法
| 方法 | 灵敏度 | 适用场景 |
|---|---|---|
| T7E1 酶切 | 5%-10% | 快速初筛 |
| Sanger 测序 + TIDE/ICE 分析 | 5%-50% | 定量编辑效率、看 indel 谱 |
| NGS（扩增子测序） | <1% | 精确效率、脱靶分析 |
| 单克隆测序 | 单个克隆 | 确认基因型 |
推荐流程：先用 T7E1 初筛 sgRNA，再用 Sanger + TIDE 定量，最后用单克隆测序确认功能敲除。
常见坑点与避坑建议
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只测了一个时间点：Cas9 切割后 48-72 h 是检测窗口，太早细胞还没修复，太晚纯合敲除细胞会丢失杂合双链信号。建议 48 h、72 h、96 h 三个时间点检测。
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PCR 引物离靶位点太远：引物距离靶位点 >500 bp 时，扩增效率下降，影响 T7E1 灵敏度。建议引物距离靶位点 100-250 bp。
-
模板质量差：基因组 DNA 降解或含抑制剂会导致 PCR 失败。用 Nanodrop 检测 A260/280 和 A260/230，必要时重新提取。
-
sgRNA 靶向非编码区：靶向内含子或 UTR 区域不会产生功能敲除，虽然能检测到 indel，但蛋白表达不受影响。
-
同源修复模板问题：如果是 HDR 实验，效率天然低于 NHEJ（通常 <10%），需要同步优化供体模板、细胞周期同步化和筛选标记。
优化决策树
T7E1 看不到切割条带
├── 转染效率 <30% → 优化转染 / 换 RNP / 换慢病毒
├── 转染效率 >70%
│ ├── sgRNA 评分低 / GC 异常 → 重新设计 2-3 条
│ ├── PCR 失败 / 引物太远 → 优化 PCR
│ ├── 检测时间太早 / 太晚 → 48-72 h 重测
│ └── 细胞支原体阳性 / 状态差 → 处理细胞
└── 能看到弱条带但效率 <10%
├── 换效率更高的 sgRNA
├── 提高 Cas9/sgRNA 表达量
└── 用 NGS 或 TIDE 精确定量何时需要重做
- 连续 2-3 条 sgRNA 效率都 <10%，且转染效率 >70%：考虑换细胞系或换递送系统
- 细胞支原体持续阳性：先清除支原体或换细胞
- HDR 实验效率始终 <1%：需要引入筛选标记或改用 base/prime editing