CRISPR 阳性克隆基因型验证全流程：T7E1 酶切、PCR 测序与 indel 判定

为什么要做基因型验证

很多同学在 CRISPR 实验上花了两三周——转染、加药、挑单克隆——然后直接去做 WB，结果看不到蛋白条带。回头一查，测序发现克隆是野生型，甚至是杂合子。

抗性筛选≠正确编辑。抗性基因（Puromycin/Blasticidin）的表达只证明细胞吸收了质粒，不代表 Cas9 真在你想要的位点切了一刀、修复出了你想要的 indel。

基因型验证是 CRISPR 流程的“最后一公里”。它回答三个问题：

1. 有没有切到？（T7E1 酶切或 NHEJ indel PCR）
2. 纯合还是杂合？（Sanger 测序峰图）
3. 测序结果对不对？（是否存在脱靶、是否双等位）

如果这三个问题答不出来，后面所有功能实验的可信度都为零。

验证方法选型

推荐组合策略：T7E1 初筛 → PCR 扩增 → Sanger 测序 → 脱靶位点抽检。下面按这个顺序展开每一步的细节。

Step 1：阳性克隆的 gDNA 快速提取

挑好单克隆后，不能直接用细胞裂解液做 PCR——裂解液中的 SDS 和蛋白酶会强烈抑制 Taq。推荐两种方法，取决于你手上有多少克隆：

方案 A：QuickExtract / 快速裂解液法（推荐）

商业的 QuickExtract DNA Extraction Solution 是最省时间的选择，20 分钟搞定 96 孔板：

1. 吸走培养基，PBS 轻洗 1 次
2. 每孔加 50 µL QuickExtract 溶液（0.5 N NaOH + Triton X-100）
3. 65°C 孵育 10 分钟（裂解）
4. 98°C 孵育 2 分钟（灭活蛋白酶）
5. 瞬时离心，直接取 2–5 µL 做 PCR

关键：裂解液终浓度 NaOH 约 0.05 N，必须中和（如果用 QuickExtract 商业液已内置中和剂；如果自己配，要加 1/10 体积 1 M Tris·Cl pH 8.0）。

方案 B：酚氯仿/硅胶柱法（克隆重要时）

如果克隆很宝贵或需要高质量 gDNA 做 NGS：

1. 消化收集约 10^5 细胞
2. 加 500 µL 裂解液（10 mM Tris·Cl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 100 µg/mL 蛋白酶 K）
3. 55°C 消化 3 小时或过夜
4. 酚氯仿抽提 + 乙醇沉淀
5. 50 µL TE 洗脱，测 A260/280

质量要求：A260/280 ≥ 1.7，A260/230 ≥ 1.5，浓度 50–200 ng/µL。低于此值会导致后续 PCR 失败。

Step 2：跨目标位点 PCR 扩增

扩增的区域必须包含 Cas9 切割位点和 PAM 序列。引物设计原则：

PCR 反应体系（50 µL）：

gDNA 模板           2–5 µL（约 100–500 ng）
10× Taq Buffer       5 µL
dNTP（10 mM 各）      1 µL
Forward Primer（10 µM）  1 µL
Reverse Primer（10 µM）  1 µL
Taq Polymerase       0.5 µL（2.5 U）
DMSO 或 Betaine      可选，1–3%（GC rich 模板用）
ddH₂O               补到 50 µL

循环条件：

95°C 3 min（热启动）
→ 35 个循环：
   95°C 15 sec（变性）
   58–62°C 30 sec（退火，Tm-3°C）
   72°C 30–60 sec（延伸，按 1 kb/min 算）
→ 72°C 5 min（末端加 A）
→ 4°C 保持

质控要求：取 5 µL 跑 2% 琼脂糖凝胶，应有单一清晰条带。如果有非特异条带，切胶回收后再做后续验证。

Step 3：T7E1 酶切检测 indel（初筛）

T7E1 酶能识别并切割杂合双链中的错配位点。原理：野生型 PCR 产物和突变型 PCR 产物退火时，indel 区域会形成错配 bubble，被 T7E1 切开产生两条新条带。

T7E1 反应体系（25 µL）

PCR 产物（未经纯化）   10 µL（约 50–100 ng）
10× Hybridization Buffer  2.5 µL
T7E1 Enzyme          1 µL（10 U）
ddH₂O               11.5 µL

退火 + 酶切程序

1. 杂交退火（在 PCR 管中直接做）：
   95°C 5 min → 梯度降温 95→25°C，每分钟降 1°C → 25°C 保持 2 min

2. 加 T7E1 酶后 37°C 孵育 30–60 min

3. 80°C 20 min 灭活

4. 跑 2% 琼脂糖凝胶，观察条带

结果判读

切割效率估算：杂合克隆的切割条带灰度值占总灰度的 30–50% 即为强阳性。如果 <10%，可能是编辑效率低或细胞不纯。

注意：T7E1 检测不能证明是你想要的 indel——只要是切割位点附近的任何 indel 都会被切开。最终一定要去测序。

Step 4：Sanger 测序与纯合/杂合判定

从 T7E1 阳性克隆中挑 3–5 个最亮的条带，PCR 产物送 Sanger 测序。

测序方向选择

峰图判读指南

场景 1：纯合 indel

切割位点附近峰图单一、清晰、没有叠峰，但序列和野生型相比少了/多了几个碱基。这是理想结果，说明两条等位基因都被编辑了。

场景 2：杂合 indel（最常见）

切割位点附近出现叠峰：前半段是单一峰，后半段是两条（或更多）峰叠加。这说明一条等位基因被编辑了，另一条没有。

判断方法：

1. 找到叠峰开始的位置（就是 Cas9 切割位点）
2. 两条等位基因的序列差异导致后续峰图分叉
3. 用 Decipher（在线工具）或手动对比野生型序列，确定 indel 大小

杂合子峰图解读常见坑：

场景 3：没峰 / 空白

PCR 失败或克隆是死的。检查细胞是否还有活性、gDNA 是否降解。

场景 4：完全没有 indel（纯合野生型）

T7E1 假阳性。可能是抗性筛选不干净，或者 Cas9 没切到。重新设计 sgRNA。

纯合/杂合判定决策树

Sanger 测序结果
├─ 纯合 indel（两条等位基因同类型 indel）→ 最佳，直接进入功能实验
├─ 杂合 indel（一条 wt + 一条 indel）→ 可用于敲低（Knockdown）效果验证
├─ 双等位不同 indel → 可能产生功能蛋白 vs 截断蛋白，需要做 WB 验证
└─ 野生型（wt/wt）→ 重新挑克隆或重新设计 sgRNA

Step 5：脱靶位点抽检

拿到阳性克隆后，不要忘记检查你最担心的脱靶位点。

如何找脱靶位点

1. 用 Cas-OFFinder 或 CRISPRscan 输入你的 sgRNA 序列
2. 默认参数下取 Top 10 预测位点
3. 排除位于已知功能基因外显子内的位点——这些优先级最高

脱靶检测方法

阈值建议：如果 Top 3 脱靶位点测序都没发现 indel，且表型符合预期，可以认为特异性足够。

全套流程时间线

常见坑点与避坑

一句话总结

QuickExtract 快速提 gDNA → 跨切割位点 PCR → T7E1 酶切筛 40 个克隆 → 挑 3–5 个阳性送 Sanger → 拆峰图判纯合/杂合 → Top 3 脱靶位点抽检。抗性筛选 ≠ 正确编辑，测序结果才是金标准。