为什么要做基因型验证
很多同学在 CRISPR 实验上花了两三周——转染、加药、挑单克隆——然后直接去做 WB，结果看不到蛋白条带。回头一查，测序发现克隆是野生型，甚至是杂合子。
抗性筛选≠正确编辑。抗性基因（Puromycin/Blasticidin）的表达只证明细胞吸收了质粒，不代表 Cas9 真在你想要的位点切了一刀、修复出了你想要的 indel。
基因型验证是 CRISPR 流程的”最后一公里”。它回答三个问题：
- 有没有切到？（T7E1 酶切或 NHEJ indel PCR）
- 纯合还是杂合？（Sanger 测序峰图）
- 测序结果对不对？（是否存在脱靶、是否双等位）
如果这三个问题答不出来，后面所有功能实验的可信度都为零。
验证方法选型
| 验证方法 | 适用场景 | 优点 | 缺点 | 推荐阶段 |
|---|---|---|---|---|
| T7E1 酶切法 | 初筛 40–96 个克隆是否有 indel | 快速、便宜、高通量 | 只能定性有/无，不能精确到具体 indel 类型 | 抗性筛选后立即做 |
| 跨 deletion 区域 PCR | 敲除（Knockout）克隆判定 | 可直接看出条带大小变化 | 缺失太大时 PCR 可能失败；插入太小看不出 | 候选克隆复筛 |
| Sanger 测序 + 峰图分析 | 最终验证、确定纯合/杂合 | 精确定位 indel 类型、位置、比例 | 杂合子峰图需要拆解解读 | 选 3–5 个阳性克隆做 |
| NGS 扩增子测序 | 大规模克隆验证、低比例 indel | 定量精确，可测脱靶位点 | 成本高、周期长 | 发表前或需要精确定量时 |
推荐组合策略：T7E1 初筛 → PCR 扩增 → Sanger 测序 → 脱靶位点抽检。下面按这个顺序展开每一步的细节。
Step 1：阳性克隆的 gDNA 快速提取
挑好单克隆后，不能直接用细胞裂解液做 PCR——裂解液中的 SDS 和蛋白酶会强烈抑制 Taq。推荐两种方法，取决于你手上有多少克隆：
方案 A：QuickExtract / 快速裂解液法（推荐）
商业的 QuickExtract DNA Extraction Solution 是最省时间的选择，20 分钟搞定 96 孔板：
1. 吸走培养基，PBS 轻洗 1 次
2. 每孔加 50 µL QuickExtract 溶液（0.5 N NaOH + Triton X-100）
3. 65°C 孵育 10 分钟（裂解）
4. 98°C 孵育 2 分钟（灭活蛋白酶）
5. 瞬时离心，直接取 2–5 µL 做 PCR关键：裂解液终浓度 NaOH 约 0.05 N，必须中和（如果用 QuickExtract 商业液已内置中和剂；如果自己配，要加 1/10 体积 1 M Tris·Cl pH 8.0）。
方案 B：酚氯仿/硅胶柱法（克隆重要时）
如果克隆很宝贵或需要高质量 gDNA 做 NGS：
- 消化收集约 10^5 细胞
- 加 500 µL 裂解液（10 mM Tris·Cl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 100 µg/mL 蛋白酶 K）
- 55°C 消化 3 小时或过夜
- 酚氯仿抽提 + 乙醇沉淀
- 50 µL TE 洗脱，测 A260/280
质量要求：A260/280 ≥ 1.7，A260/230 ≥ 1.5，浓度 50–200 ng/µL。低于此值会导致后续 PCR 失败。
Step 2：跨目标位点 PCR 扩增
扩增的区域必须包含 Cas9 切割位点和 PAM 序列。引物设计原则：
| 参数 | 要求 | 原因 |
|---|---|---|
| 扩增片段长度 | 200–600 bp | 太短（<150 bp）看不出 indel 变化；太长（>1 kb）测序质量下降 |
| 引物结合位置 | 距切割位点 ≥ 30 bp | 避免切割本身影响引物结合效率 |
| GC 含量 | 40–60% | 低了不稳定，高了形成二级结构 |
| Tm | 58–62°C，两者相差 ≤ 3°C | 保证同时退火 |
| 特异性验证 | NCBI Primer-BLAST | 必须只命中目标基因，否则会扩增到同源区 |
PCR 反应体系（50 µL）：
gDNA 模板 2–5 µL（约 100–500 ng）
10× Taq Buffer 5 µL
dNTP（10 mM 各） 1 µL
Forward Primer（10 µM） 1 µL
Reverse Primer（10 µM） 1 µL
Taq Polymerase 0.5 µL（2.5 U）
DMSO 或 Betaine 可选，1–3%（GC rich 模板用）
ddH₂O 补到 50 µL循环条件：
95°C 3 min（热启动）
→ 35 个循环：
95°C 15 sec（变性）
58–62°C 30 sec（退火，Tm-3°C）
72°C 30–60 sec（延伸，按 1 kb/min 算）
→ 72°C 5 min（末端加 A）
→ 4°C 保持质控要求：取 5 µL 跑 2% 琼脂糖凝胶，应有单一清晰条带。如果有非特异条带，切胶回收后再做后续验证。
Step 3：T7E1 酶切检测 indel（初筛）
T7E1 酶能识别并切割杂合双链中的错配位点。原理：野生型 PCR 产物和突变型 PCR 产物退火时，indel 区域会形成错配 bubble，被 T7E1 切开产生两条新条带。
T7E1 反应体系（25 µL）
PCR 产物（未经纯化） 10 µL（约 50–100 ng）
10× Hybridization Buffer 2.5 µL
T7E1 Enzyme 1 µL（10 U）
ddH₂O 11.5 µL退火 + 酶切程序
1. 杂交退火（在 PCR 管中直接做）：
95°C 5 min → 梯度降温 95→25°C，每分钟降 1°C → 25°C 保持 2 min
2. 加 T7E1 酶后 37°C 孵育 30–60 min
3. 80°C 20 min 灭活
4. 跑 2% 琼脂糖凝胶，观察条带结果判读
| 条带表现 | 结论 | 说明 |
|---|---|---|
| 只有 1 条带（和原始 PCR 大小一致） | 没有 indel / 纯合 indel（极少见） | 假阴性可能：纯合 indel 不会有错配 |
| 3 条带（1 大 2 小） | 杂合 indel | 两条小条带大小之和 ≈ 大条带 |
| 只有 2 条带（野生型 + 突变型） | 纯合 indel | 缺失/插入刚好改变了片段大小 |
| 条带拖尾或模糊 | PCR 产物不纯 | 切胶回收后重跑 |
切割效率估算：杂合克隆的切割条带灰度值占总灰度的 30–50% 即为强阳性。如果 <10%，可能是编辑效率低或细胞不纯。
注意：T7E1 检测不能证明是你想要的 indel——只要是切割位点附近的任何 indel 都会被切开。最终一定要去测序。
Step 4：Sanger 测序与纯合/杂合判定
从 T7E1 阳性克隆中挑 3–5 个最亮的条带，PCR 产物送 Sanger 测序。
测序方向选择
| 测序方向 | 适用情况 | 注意 |
|---|---|---|
| Forward Primer | 切割位点靠近 Forward 引物 | indel 序列从 PAM 开始读 |
| Reverse Primer | 切割位点靠近 Reverse 引物 | 注意互补链方向 |
| 双向测序（推荐） | 杂合子拆解 | 两个方向互相验证，避免读错 |
峰图判读指南
场景 1：纯合 indel
切割位点附近峰图单一、清晰、没有叠峰，但序列和野生型相比少了/多了几个碱基。这是理想结果，说明两条等位基因都被编辑了。
场景 2：杂合 indel（最常见）
切割位点附近出现叠峰：前半段是单一峰，后半段是两条（或更多）峰叠加。这说明一条等位基因被编辑了，另一条没有。
判断方法：
- 找到叠峰开始的位置（就是 Cas9 切割位点）
- 两条等位基因的序列差异导致后续峰图分叉
- 用 Decipher（在线工具）或手动对比野生型序列，确定 indel 大小
杂合子峰图解读常见坑：
| 坑点 | 表现 | 避免方法 |
|---|---|---|
| 编辑位点在测序起始端 | 测序刚开始就叠峰，前面的引物结合区域也被编辑 | 引物设计时离切割位点 ≥ 50 bp |
| 纯合 indel 被误判为杂合 | 测序反应本身有杂质导致叠峰 | 重新 PCR 送样 |
| 多克隆混合 | 叠峰模式混乱、难以拆解 | 重新挑单克隆，用有限稀释法提高纯度 |
| 双向测序结果矛盾 | 一个方向显示 indel，另一个没有 | 检查哪个方向离切割位点更近；可能是测序质量差 |
场景 3：没峰 / 空白
PCR 失败或克隆是死的。检查细胞是否还有活性、gDNA 是否降解。
场景 4：完全没有 indel（纯合野生型）
T7E1 假阳性。可能是抗性筛选不干净，或者 Cas9 没切到。重新设计 sgRNA。
纯合/杂合判定决策树
Sanger 测序结果
├─ 纯合 indel（两条等位基因同类型 indel）→ 最佳，直接进入功能实验
├─ 杂合 indel（一条 wt + 一条 indel）→ 可用于敲低（Knockdown）效果验证
├─ 双等位不同 indel → 可能产生功能蛋白 vs 截断蛋白，需要做 WB 验证
└─ 野生型（wt/wt）→ 重新挑克隆或重新设计 sgRNAStep 5：脱靶位点抽检
拿到阳性克隆后，不要忘记检查你最担心的脱靶位点。
如何找脱靶位点
- 用 Cas-OFFinder 或 CRISPRscan 输入你的 sgRNA 序列
- 默认参数下取 Top 10 预测位点
- 排除位于已知功能基因外显子内的位点——这些优先级最高
脱靶检测方法
| 方法 | 适用场景 | 说明 |
|---|---|---|
| 同一套 PCR → T7E1/测序 | 有明确的 Top 3–5 位点 | 快速、便宜，和靶点验证流程一样 |
| GUIDE-seq | 系统级脱靶扫描 | 成本高，发表级数据需要 |
| 直接做 RNA-seq/WB 看表型 | 功能验证层面 | 如果没看到意外表型，通常可以暂时放过 |
阈值建议：如果 Top 3 脱靶位点测序都没发现 indel，且表型符合预期，可以认为特异性足够。
全套流程时间线
| Day | 操作 | 时长 |
|---|---|---|
| Day 0 | 转染 Cas9 + sgRNA | 2 h |
| Day 2 | 加抗性筛选 | 30 min |
| Day 5–8 | 换抗性液，观察死亡 | 10 min/天 |
| Day 10–14 | 挑单克隆到 96 孔板 | 3 h |
| Day 14–18 | 阳性孔消化、gDNA 提取、PCR 扩增 | 4 h |
| Day 18–19 | T7E1 酶切初筛 | 1 h |
| Day 19–20 | 送 Sanger 测序（选 3–5 个最亮阳性） | 等待测序 |
| Day 22–23 | 拆峰图、判定纯合/杂合 | 2 h |
| Day 23+ | 脱靶位点抽检、功能实验 | — |
常见坑点与避坑
| 坑点 | 表现 | 根因 | 解决方案 |
|---|---|---|---|
| 抗性筛选后全死 | 没有存活克隆 | 抗性浓度太高 / 转染效率太低 | 先做 kill curve 确定抗性浓度；转染后 24 h 加药 |
| T7E1 全部阴性 | 所有克隆都只有 1 条带 | sgRNA 设计差 / Cas9 不表达 | 换 2–3 条新 sgRNA；做 Western 检查 Cas9 蛋白 |
| T7E1 有切割但测序没 indel | 测序结果显示 wt | PCR 扩增了多个同源区 | Primer-BLAST 检查特异性；切胶回收纯 PCR 条带 |
| Sanger 峰图乱得拆不动 | 叠峰严重 | 克隆不纯 / 多等位编辑 | 有限稀释重新挑单克隆；或考虑 NGS 扩增子 |
| 纯合 indel 但 WB 仍有条带 | 敲除”不彻底” | 可能是框架内 indel（非敲除） | 读码框分析；选择移码 indel 的克隆 |
| 测序送样失败 | 测序公司返回空数据 | PCR 产物浓度太低 / 有污染 | NanoDrop 定量；乙醇沉淀再送样 |
一句话总结
QuickExtract 快速提 gDNA → 跨切割位点 PCR → T7E1 酶切筛 40 个克隆 → 挑 3–5 个阳性送 Sanger → 拆峰图判纯合/杂合 → Top 3 脱靶位点抽检。抗性筛选 ≠ 正确编辑，测序结果才是金标准。