概述
CRISPR-Cas9 基因编辑已经成为几乎所有分子生物学实验室的必备技术。但新手第一次做 CRISPR 实验时，经常会遇到”为什么转染了却没编辑？""为什么抗性筛选后细胞都死了？""为什么测序结果不对？“这类问题。这些问题大多不是”运气不好”，而是流程中某个环节漏掉了关键检查。
本文按照 CRISPR 实验的时间先后顺序，把整个流程拆解为 6 个阶段、30 个关键检查点。在动手做实验之前，建议把这份 Checklist 打印出来，每完成一项打一个勾。如果最终实验结果不理想，拿着 Checklist 往回查，大概率能定位到问题出在哪一步。
阶段一：实验前准备（Day -7 至 Day -3）
目标：在动任何细胞之前，把靶基因、细胞系、递送方法这三个核心选择都敲定。这一步的决策直接决定了后续实验的成败。
1. 靶基因位点确认
- 确认靶基因的转录本 ID（Transcript ID）：用 Ensembl 或 NCBI Gene 数据库，选表达丰度最高的转录本作为参考
- 确定是敲除（KO）还是敲入（KI）：KO 通常破坏外显子，KI 涉及同源重组或 NHEJ 介导的插入
- 确认 PAM 序列（NGG）的位置：SpCas9 需要 5’-NGG-3’ PAM，就在你要编辑的目标位点附近必须有一个 NGG
- 检查靶位点是否位于必需功能域：如果敲除的是假基因或可变剪接外显子，可能导致无效编辑（转录本仍然产生有功能的蛋白）
2. 细胞系与培养条件
- 确认细胞系的种属和倍性：同一个靶基因在不同种属中 PAM 分布完全不同；多倍体细胞（如部分癌细胞）可能需要编辑多个拷贝
- 细胞没有支原体污染：PCR 或测序验证。支原体污染会严重降低转染效率和 Cas9 表达
- 细胞处于对数生长期：实验前 2 天传代一次，确保转染时细胞活力 > 90%
- 确定选择标记抗性：如果用质粒递送，需要确认 G418/Puromycin/Blasticidin 的杀伤曲线（至少做一次 kill curve 实验）
3. 递送方式选择
| 递送方式 | 适用场景 | 编辑效率 | 成本 | 难度 |
|---|---|---|---|---|
| 质粒转染 | 稳定细胞系构建、长期表达 Cas9 | 中（10-30%） | 低 | 低 |
| RNP 直接递送 | 瞬时编辑、避免 Cas9 持续表达 | 高（30-70%） | 中 | 中 |
| 慢病毒（Lentivirus） | 难转染的细胞、原代细胞、稳定整合 | 很高（依赖 MOI） | 高 | 高 |
| 腺相关病毒（AAV） | 体内实验、特定组织递送 | 高（组织依赖） | 很高 | 很高 |
| 电穿孔（Nucleofection） | 悬浮细胞、原代细胞 | 很高 | 中（仪器） | 中 |
- 已经确定递送方式并在实验记录本中说明理由
阶段二：sgRNA 设计（Day -5 至 Day -2）
目标：设计 2-4 条高质量 sgRNA。这是整个流程中最影响最终编辑效率的一步。
4. sgRNA 核心设计原则
- sgRNA 长度：19-20 nt（不含 PAM），过长或过短都会降低效率
- GC 含量：40-60% 最佳。GC < 30% 结合力弱，GC > 70% 容易形成二级结构
- PAM 选择：SpCas9 用 NGG，位置在 sgRNA 的 3’ 端紧邻处（sgRNA = 20 nt + NGG PAM）
- 避免 poly-T 或 poly-G：连续 4+ 个 T 会导致 Pol III 转录提前终止（如果用 U6 启动子驱动）
5. 功能位点选择
- KO 实验：优先选编码区 50-70% 区域的外显子（位于起始密码子之后、终止密码子之前），不要选前 5%（可能有 alternative start codon）或后 30%（可能产生截短蛋白）
- KI 实验：靶点应位于插入位点附近，最好在需要被替换的区域内部
- 同一条靶序列不要在多个外显子上重复出现：避免同时编辑多个外显子
6. 脱靶预测
- 用 CRISPRscan、benchling.com 或 offinder 做脱靶预测
- off-target 评分 < 5 的优先（不同工具评分体系不同，选各自评分最优的 2-4 条）
- 检查是否存在 off-target 在编码区：如果有且评分较高，放弃这条 sgRNA
7. sgRNA 数量与验证
- 设计 3-4 条候选 sgRNA，不要只设计 1 条
- 考虑合成 1 条 control sgRNA：可以是非靶向性（scrambled）、靶向一个已知可编辑但无功能的基因、或靶向 GFP/luciferase
- 如果是 RNP 递送方式：可以考虑化学修饰 sgRNA（2’-O-methyl + phosphorothioate），提高体内稳定性和编辑效率
阶段三：转染/递送（Day 0 至 Day +2）
目标：把 Cas9 和 sgRNA 递送到细胞内。根据递送方式不同，这里可能是转染质粒、电穿孔、病毒感染或直接递送 RNP。
8. 转染前的细胞准备
- 转染当日细胞密度 50-70%：太高 → 接触抑制导致转染效率低；太低 → 死亡
- 细胞贴壁时间 ≥ 24 小时：确保细胞充分贴附后再处理
- 转染前 2-4 小时换新鲜培养基（不含抗生素）：抗生素会增加转染时的细胞死亡
- 铺板时设置对照孔：空白对照（只换培养基）、阴性对照（转染 scrambled sgRNA）、阳性对照（已知高效的靶标 sgRNA）
9. 质粒转染检查点
- 质粒 DNA 质量：A260/A280 = 1.8-2.0，A260/A230 > 2.0，无蛋白/多糖污染
- 转染试剂与质粒 DNA 比例已优化（参考试剂说明书的最优比例，必要时做梯度测试）
- 如果用 Lipofectamine 类试剂：注意转染后 6-24 小时要换培养基，避免试剂毒性
10. 慢病毒/AAV 感染检查点
- 病毒滴度已测定（至少做过一次 serial dilution 测 TCID50）
- MOI 值已确定：常用 0.5-5.0 MOI，根据细胞类型调整（原代细胞可能需要 10+ MOI）
- 感染时培养基不含血清（可以加少量血清但不要全浓度），感染后 4-12 小时换回完全培养基
- 有 polybrene（感染增强剂）吗？：部分细胞株需要 4-8 μg/mL polybrene 提高感染效率
11. RNP 直接递送检查点
- Cas9 蛋白与 sgRNA 已形成复合物：按 1:1 或 1:2 摩尔比混合，室温孵育 10-15 分钟后再处理细胞
- 不要把 Cas9 和 sgRNA 分开加给细胞：它们需要在体外预组装才能高效切割
12. 电穿孔检查点
- 电穿孔条件已针对你的细胞系优化：电压、电容、脉冲时间都会影响存活率和编辑效率
- 电穿孔后立即预热培养基并缓慢加入细胞：避免快速温度变化和机械损伤
阶段四：筛选与富集（Day +3 至 Day +14）
目标：把成功递送了 Cas9/sgRNA 的细胞富集出来。如果是质粒递送带抗性标记，用抗生素筛选；如果是瞬时递送，直接用 pool 做后续分析（不筛选）。
13. 抗生素筛选
- Kill curve 已做：在同批细胞上，用 2×、1×、0.5× 工作浓度测试 3-5 天的细胞死亡时间。浓度太低 → 无法富集；浓度太高 → 细胞都死光
- 筛选时间 3-7 天：空白对照孔（未转染的细胞）应该在第 3-5 天几乎全部死亡
- 筛选开始前 48-72 小时再加药：给细胞时间表达抗性基因
- 筛选期间每天观察：如果大量细胞死亡，考虑降一点抗生素浓度
14. 流式细胞术富集（如果带荧光标记）
- 如果质粒带 GFP/RFP 标记：在转染后 48-72 小时用 FACS 分选荧光阳性细胞
- 分选阈值：只分选中上 30-50% 最强荧光的细胞，避免分选到表达量太低的弱阳性细胞
- 分选后立即接种到新培养板：密度不要太低（至少 1000 个/cm²），单细胞太稀疏会死
15. 富集后培养
- pool 编辑效率评估（Day +7-10）：取 200-500 个细胞做 PCR + T7 Endonuclease I 检测或直接测序，初步评估 indel 率
- 如果 pool indel 率 < 10%：不要急着挑单克隆，先回到 sgRNA 设计阶段换一条新的 sgRNA 重试
阶段五：基因型验证（Day +10 至 Day +30）
目标：确定编辑后的细胞到底被改成了什么样。这是很多新手跳过但绝对不能省的一步。
16. DNA 提取与靶位点扩增
- 提取细胞基因组 DNA：可以用快速裂解方法（如 QuickExtract）或正规试剂盒
- 设计扩增引物：靶点上下游各 200-300 bp，扩增产物在 400-800 bp 范围最适合
- 引物不会扩增多个位点：用 BLAST 检查扩增特异性
17. 初步检测方法选择
| 检测方法 | 原理 | 能检出 indel 类型 | 优缺点 |
|---|---|---|---|
| T7 Endonuclease I 分析 | 检测野生型与突变型 DNA 形成的异源双链中的错配位点 | 小 indel（1-50 bp） | 快但不精确，无法判断 indel 类型 |
| Surveyor Assay（CEL I） | 原理同上，用 CEL I 酶 | 小 indel | 比 T7 更敏感 |
| HRM（高分辨率熔解曲线） | 突变导致的熔解温度变化 | 小 indel + 点突变 | 高通量，但需要 HRM 仪器 |
| 直接测序 + CRISPResso | Sanger 测序后对比野生型 | 所有 indel 类型 | 最准确，推荐所有样本都做 |
| 深度测序（NGS） | 大量扩增子测序分析 indel 频率 | 所有 indel 类型，可量化频率 | 成本高，适合 pool 分析 |
- 至少用 2 种方法交叉验证：推荐直接测序（作为金标准）+ T7 酶切（作为快速筛查）
18. 单克隆细胞株基因型鉴定（如果需要 clonal line）
- 每个候选单克隆至少做 3 次独立测序验证（避免假阳性）
- 确认是 biallelic knockout（KO 实验）：KO 成功的标志是两条等位基因都被破坏，没有保留任何有功能的野生型序列
- 如果是杂合突变：记录两条等位基因分别是什么 indel 类型
- KI 实验：需要专门检测插入/替换的方向、位点是否正确，必要时做 long-range PCR + 测序
19. 功能验证
基因型正确不等于基因功能完全丧失。补充做：
- 目标基因 mRNA 水平检测：qPCR 验证（可能因 NMD 导致 mRNA 降解）
- 目标蛋白表达检测：Western Blot 验证（KO 应该检测不到条带，KI 应该有条带）
- 表型验证：如果已知该基因的功能，检测对应的细胞表型是否变化
阶段六：脱靶检测与终验（Day +20 至 Day +35）
目标：确认最终得到的编辑细胞株，除了靶位点以外，没有被 Cas9 误切了基因组其他位置。
20. 脱靶位点筛选
- 回到你最初设计 sgRNA 时用的脱靶预测工具，找出评分前 10-20 的高风险 off-target 位点
- 设计这些位点的 PCR 扩增引物
- 用 Sanger 测序逐个验证（pool 样本 + 最终单克隆）
- 如果 off-target 位点也有 indel：评估是否影响研究结果（例如 off-target 位于非编码区、假基因、或与研究表型无关）
21. 无偏脱靶检测（可选但推荐）
如果你非常在意脱靶风险，可以考虑：
- GUIDE-seq：全基因组无偏脱靶检测
- CIRCLE-seq：体外 Cas9 切割基因组 DNA 检测所有可能的切割位点
- Digenome-seq：Cas9 处理基因组后测序，检测双链断裂
这些方法成本较高，但适合在发表前作为最终验证。
22. 细胞库建立
- 对验证通过的单克隆细胞株做种属鉴定（STR 或 SNP 指纹，避免交叉污染）
- 至少冻存 3-5 管种子细胞（早期代数），标记清楚基因型、日期和位置
- 细胞系在传代超过 15-20 代后重新测序验证（防止回复突变或额外编辑积累）
快速决策路径
如果你时间紧张或者第一次做 CRISPR，以下是最小可行流程：
第 1 周（准备）：
选靶基因 → 设计 3 条 sgRNA → 订购 → 做 kill curve
第 2 周（转染）：
铺板细胞 → 转染/递送 Cas9 + sgRNA → 加筛选抗生素
第 3 周（富集与 pool 验证）：
抗生素筛选 → 收集 pool 细胞 → 提取 DNA → T7 酶切 + 直接测序
第 4 周（单克隆）：
如果 pool indel 率 > 20%：
→ 有限稀释挑单克隆 → 扩增 → 逐个测序验证
第 5-6 周（终验）：
选 2-3 个纯合 KO 克隆 → 做 qPCR + Western 验证 → 冻存种子常见”卡壳”场景快速排查
场景 1：转染后细胞大量死亡（>70%）
快速排查顺序：
- 转染试剂是否过期 / 比例是否正确？
- 细胞密度太低（<40%）还是太高（>90%）？
- 培养基里是否有抗生素（会加重转染毒性）？
- 是否考虑用 RNP 直接递送（比质粒毒性低）？
场景 2：pool 编辑效率极低（<5%）
快速排查顺序：
- sgRNA 是否选对了功能位点？（查参考文献有没有人用同一条 sgRNA 成功）
- sgRNA GC 含量是否在 40-60%？
- 是不是需要换 Cas9 表达载体（不同启动子驱动效率差异大）？
- 如果用质粒，考虑改用 RNP 直接递送（瞬时编辑更高效）
场景 3：T7 酶切条带正常但测序不对
快速排查顺序：
- 测序用的 PCR 引物是否跨越足够多的侧翼序列？
- 是不是 pool 太杂，建议分选单克隆再测序？
- 有没有可能 sgRNA 同时编辑了同基因的另一个同源位点？
场景 4：筛选后所有细胞都死了
快速排查顺序：
- Kill curve 做过吗？抗生素浓度是不是太高了？
- 筛选时间是不是太早了？（应该等抗性基因充分表达）
- 检查质粒是否带了正确的抗性标记？
核心记忆点
- sgRNA 质量决定 80% 成功率：宁可花一周选好 sgRNA，不要为了快选一条”看起来能用”的
- 对照是实验的生命线：scrambled control + 空白对照 + 已知阳性对照，三者都要有
- pool 先做再挑单克隆：先看 pool indel 率，如果 pool 都切不动，挑单克隆就是浪费时间
- 基因型 + 表型双重验证：基因被切了 ≠ 功能被破坏了
- 留好种子细胞：早期代数冻存，后期不会因为回复突变而前功尽弃
本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。