为什么流式样本制备比上机操作更重要
流式细胞术的结果质量 = 样本质量 × 仪器设置 × 分析方法。仪器和分析可以靠经验和软件弥补，但样本质量差是不可逆的：死细胞会非特异结合抗体、细胞碎片会增加背景自发荧光、染色不均会导致群体弥散无法分群。
很多同学把精力放在补偿和设门上，却忽视了上机前的样本制备。实际上，80% 的流式结果问题源于样本制备环节。本文给出一套可直接套用的标准流程。
一、样本制备总流程
细胞收集 → 活率检查 → 计数 → 分装 → Fc 封闭 → 死活染色 → 抗体染色 → 洗涤 → 上机每个环节的失败模式不同，下面逐项拆解。
二、细胞收集与活率
1. 不同样本的收集方法
| 样本类型 | 收集方法 | 关键注意 |
|---|---|---|
| 悬浮细胞（ Jurkat、THP-1） | 直接吹打，300 g × 5 min 离心 | 不用胰酶，避免损伤膜蛋白 |
| 贴壁细胞（HEK293、Hela） | 0.25% 胰酶消化 1–2 min，加培养基终止 | 消化过度会让膜蛋白被切掉，影响表面染色 |
| 原代细胞 / 组织 | 胶原酶或机械研磨 + 70 μm 筛网过滤 | 过滤去除团块和碎片 |
| 外周血 PBMC | Ficoll 密度梯度离心 | 吸取白膜层时不要吸到红细胞 |
胰酶消化的坑： 胰酶会切掉部分表面抗原（如 CD4、CD8 对胰酶敏感）。如果检测这些抗原，用无 EDTA 的胰酶或用细胞刮轻轻刮下，减少消化时间。
2. 活率要求
流式对细胞活率的最低要求是 > 85%，最佳是 > 95%。
| 活率 | 后果 | 处理 |
|---|---|---|
| > 95% | 理想，死活染色阴性群清晰 | 正常上机 |
| 85–95% | 可接受，需用死活染料排除死细胞 | 必须加死活染色 |
| 70–85% | 死细胞非特异结合严重，背景高 | 重新制备样本或用死细胞去除试剂盒 |
| < 70% | 结果不可靠 | 弃用，重新制备 |
3. 细胞计数与浓度
上机前必须计数，调整到合适浓度：
| 仪器类型 | 推荐浓度 | 上样体积 | 备注 |
|---|---|---|---|
| 常规流式（BD FACSCanto、Bio-Rad ZE5） | 1 × 10⁶ 个/mL | 200–500 μL | 每管至少 2 × 10⁵ 个细胞 |
| 高速分选（BD FACSAria、Sony MA900） | 5–10 × 10⁶ 个/mL | 1–2 mL | 浓度太低分选效率差 |
| 稀有细胞检测（< 0.1%） | 5–10 × 10⁶ 个/mL | 500 μL – 1 mL | 需要更多细胞才能收集到足够事件 |
计数工具参考： 可用站内 稀释计算器 计算需要的加样体积，避免浓度算错。
三、死活染色
死活染色是流式实验的必做对照，原因：死细胞的细胞膜通透性增加，会非特异结合大量抗体，导致假阳性。
| 死活染料 | 激发光 | 结合方式 | 适用 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| PI（碘化丙啶） | 488 nm | 嵌入 DNA，只能染死细胞 | 表面染色，488 激光器 | 便宜，与 FITC/PE 通道部分重叠，需注意补偿 |
| 7-AAD | 488 nm | 嵌入 DNA | 表面染色 | 比 PI 光谱更窄，补偿更易 |
| DAPI | 355 nm（紫外） | 嵌入 DNA | 表面染色 | 需要紫外激光器 |
| Zombie 系列 | 多种 | 结合胺基，可固定后用 | 需固定通透的实验 | 固定后信号不丢失，胞内染色首选 |
| Live/Dead Fixable | 多种 | 结合胺基 | 需固定通透的实验 | 同上，多色可选 |
操作要点：
- 表面染色实验：抗体染色完成后、上机前 5 min 加入 PI 或 7-AAD，不用洗涤直接上机
- 胞内染色实验：在通透前用 Zombie 或 Live/Dead Fixable 染色，通透后死活染料会漏出
- 死活染料浓度按说明书，过高会染活细胞
四、Fc 封闭
Fc 受体（FcγR）在髓系细胞（单核细胞、巨噬细胞、DC）和 B 细胞上表达，会与抗体的 Fc 段非特异结合，导致背景升高。
| 封闭剂 | 适用物种 | 使用浓度 | 孵育时间 |
|---|---|---|---|
| 抗 CD16/CD32（2.4G2） | 小鼠 | 1 μg / 10⁶ 细胞 | 4°C 10–15 min |
| 人 IgG 或血清 | 人 | 10% v/v | 4°C 15–30 min |
| 大鼠血清 / 兔血清 | 大鼠/兔 | 5–10% v/v | 4°C 15 min |
注意： T 细胞和 NK 细胞不表达 FcγR，理论上不需要封闭，但实际操作中统一封闭不会有坏处。
五、抗体染色
1. 表面染色标准流程（10⁶ 细胞/管）
- 离心收集：300 g × 5 min，弃上清
- Fc 封闭：加 50 μL 封闭剂，4°C 15 min
- 加抗体：用染色缓冲液（PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3）稀释抗体到工作浓度，每管加 50 μL，4°C 避光 30 min
- 洗涤：加 2 mL 染色缓冲液，300 g × 5 min，弃上清
- 重悬：加 200–500 μL 染色缓冲液或死活染料，上机
2. 胞内染色（细胞因子、转录因子）
胞内染色需要固定 + 通透，让抗体进入细胞内。
| 步骤 | 试剂 | 时间温度 |
|---|---|---|
| 表面染色（先做） | 抗体 | 4°C 30 min |
| 固定 | 1–4% 多聚甲醛 | 室温 15 min |
| 通透 | 0.1–0.5% Triton X-100 或通透缓冲液 | 室温 15 min |
| 胞内一抗 | 通透缓冲液稀释抗体 | 4°C 30 min |
| 洗涤 | 通透缓冲液洗 2 次 | — |
注意： 通透会破坏部分表面抗原，如果同时检测表面和胞内抗原，先染表面抗原再通透。Triton X-100 会破坏脂质膜，通透后膜表面抗原可能丢失，可改用皂素（saponin）。
3. 核内染色（Ki-67、转录因子）
核内染色需要更强的通透剂，常用 Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience）或同类试剂盒，操作严格按说明书。
六、抗体滴定（最关键的一步）
抗体浓度不是”按说明书 1:100 稀释”就够了，必须自己滴定。同一管抗体在不同细胞、不同仪器上的最优浓度可能差 2–4 倍。
滴定方法
用 3–4 个浓度梯度对已知阳性和阴性细胞染色，选择阳性群 MFI 最高、阴性群背景最低的浓度。
| 抗体类型 | 推荐起始浓度 | 滴定梯度 |
|---|---|---|
| 直标抗体 | 0.5 μg / 10⁶ 细胞 | 0.125 / 0.25 / 0.5 / 1.0 μg |
| 一抗（间接法） | 1 μg / 10⁶ 细胞 | 0.25 / 0.5 / 1.0 / 2.0 μg |
| 二抗 | 1 μg / 10⁶ 细胞 | 0.25 / 0.5 / 1.0 μg |
判断标准：
- 阳性/阴性分离比（Staining Index）最大的浓度为最优
- 如果高浓度和低浓度信号差不多，选低浓度（省钱、降低背景）
抗体稀释工具
站内提供 稀释计算器 和 摩尔浓度换算，可快速算出从储液到工作液的加样体积。
七、对照设置
流式实验必须设置的对照：
| 对照类型 | 作用 | 设置方法 |
|---|---|---|
| 空白对照（未染色） | 调节各通道 PMT 电压 | 未染色细胞，每管单独设电压 |
| 单染对照 | 计算补偿矩阵 | 每个荧光通道一管单染 |
| FMO 对照 | 确定阳性门位置 | 除目标通道外其他通道都染 |
| 同型对照 | 判断非特异结合 | 同物种同亚型的无关抗体 |
| 阳性 / 阴性对照 | 验证抗体特异性 | 已知表达和不表达的细胞 |
FMO 对照是多色实验必须做的：单染对照只能算补偿，但不能告诉你”这个通道的阳性门应该画在哪里”。比如 FITC 通道的阳性信号可能被 PE 的溢出影响，FMO 对照（染了 PE 但没染 FITC）能帮你确定 FITC 的阴性边界。
八、上机前最后检查
- 过滤：用 70 μm 筛网过滤样本，去除细胞团块，防止堵塞流式细胞仪喷嘴
- 浓度：确认细胞浓度在 1 × 10⁶ 个/mL 左右
- 死活：确认已加死活染料
- 避光：样本管裹铝箔，上机前不要暴露在强光下
- 对照齐全：空白、单染、FMO 都准备好
九、常见问题排查
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 碎片多、FSC/SSC 左下角一团 | 细胞活力低、消化过度 | 重新制备样本，优化消化时间 |
| 细胞聚集、上样慢 | 细胞浓度过高、未过滤 | 稀释 + 70 μm 筛网过滤 |
| 背景高、阴性群偏右 | 死细胞多、未 Fc 封闭、抗体浓度高 | 加死活染色、Fc 封闭、滴定抗体 |
| 阳性信号弱 | 抗体浓度低、孵育时间短、通透不充分 | 提高抗体浓度、延长孵育、检查通透剂 |
| 各管间信号差异大 | 染色操作不一致、细胞数差异大 | 统一染色流程、每管细胞数一致 |
| 补偿后仍有溢出 | 单染对照荧光太强/太弱 | 重新制备单染对照，调整抗体浓度 |
| 上机后喷嘴堵塞 | 细胞团块、碎片多 | 停机清洗喷嘴，样本重新过滤 |
十、常用试剂配方
| 试剂 | 配方 | 用途 |
|---|---|---|
| 染色缓冲液 | PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 | 抗体稀释和洗涤 |
| FACS 缓冲液 | PBS + 2% FBS + 0.1% NaN3 | 通用洗涤 |
| 通透缓冲液 | PBS + 0.1% Triton X-100 + 1% BSA | 胞内染色通透 |
| 固定液 | PBS + 1–4% 多聚甲醛 | 样本固定 |
NaN3 有毒且会抑制 HRP，做胞内 HRP 信号的实验不要加。