概述
免疫荧光（IF）染色后通常需要定量评价蛋白表达水平或共定位关系，仅靠”肉眼看荧光强弱”无法发表文章。ImageJ/FIJI 提供荧光强度定量工具（可计算校正总细胞荧光强度 CTCF）和共定位分析插件 Coloc2（计算 Pearson、Manders 系数），适用于贴壁细胞、组织切片的免疫荧光或共聚焦显微镜图像分析。
本指南适用于单通道或多通道荧光图像的定量分析，不适用于活细胞动态成像的时间序列分析。
软件准备
- 访问 FIJI 官网（https://imagej.net/software/fiji/）下载对应操作系统版本
- FIJI 预装 Coloc2、Bio-Formats 等常用插件，可直接打开 .lif、.czi、.nd2 等共聚焦原始格式
- 解压后启动 FIJI
- 若打开共聚焦文件失败，更新 Bio-Formats 插件（
Help → Update）
操作步骤
步骤一：导入图片
File → Open 或拖拽图像到 FIJI 窗口。共聚焦原始文件（.czi、.lif）会弹出 Bio-Formats 导入对话框，建议选择 View stack with Hyperstack 打开多通道叠加图。
步骤二：拆分通道
Image → Color → Split Channels。多通道图像拆分为多个单通道灰度图（C1=DAPI、C2=绿色、C3=红色等），便于单独定量。
步骤三：选择 ROI（感兴趣区）
- 用自由手绘工具（快捷键
t）或椭圆工具（e）框选单个细胞 Analyze → Tools → ROI Manager，点击 Add（快捷键t）保存当前 ROI- 多个细胞重复此步，建立 ROI 列表
- 也可用 Freehand selections 勾画整个细胞轮廓，分别测量胞核和胞质区荧光
步骤四：测量荧光强度
Analyze → Set Measurements：勾选 Area、Mean gray value、Integrated density、Limit to threshold- 选中所有 ROI（ROI Manager 中 Shift+点击首末），点 Measure
- Results 窗口显示每个 ROI 的 Area、Mean、IntDen
步骤五：计算 CTCF
CTCF（Corrected Total Cell Fluorescence）= IntDen − (Area × Mean of background)
操作步骤：
- 在无细胞区域画一个相同大小的 ROI 作为背景
- 测量背景 Mean gray value
- 在 Excel 中按公式计算 CTCF，避免不同视野背景差异造成的偏差
步骤六：共定位分析（Coloc2）
- 合并需要分析的通道：
Image → Color → Merge Channels - 选中合并图像，
Analyze → Colocalization → Coloc 2 - 在弹出窗口中：
- ROI: 选择整个细胞或特定 ROI
- 勾选 Pearson’s R coefficient、Manders’ M1/M2 coefficients
- Costes significance test: 勾选自动阈值
- 点击 OK，软件输出报告，包含：
- Pearson’s R（-1 到 1，越接近 1 共定位越强）
- Manders’ M1/M2（0 到 1，分别为通道 1 与通道 2 重叠比例）
- 散点图（横轴通道 1 强度，纵轴通道 2 强度）
结果导出
- 荧光强度测量：Results 窗口 →
File → Save As→ .csv - Coloc2 报告：在结果窗口
File → Save As截图保存，或保存日志为 .txt - 用 Excel 整理各组 CTCF 数据
- 共定位数据汇总 Pearson R 和 Manders 系数，比较组间差异
- 用 GraphPad Prism 做 t 检验或方差分析
常见问题
背景扣除
必须做背景扣除，否则 CTCF 偏高。背景 ROI 应选无细胞、无自发荧光的区域，每个图像测 3-5 个背景 ROI 取均值。
图片格式要求
共聚焦显微镜原始格式（.czi、.lif、.nd2）保留完整元数据，推荐直接用 Bio-Formats 打开。导出的 TIFF 也行，但不要用 JPEG——压缩会破坏荧光强度信息。
阈值设置
Mean gray value 易受背景影响，建议用 Integrated density 配合背景扣除做定量。Limit to threshold 选项只在设过阈值时生效，否则会忽略阈值。
注意事项
- 图片分辨率和像素深度：建议 ≥8-bit（共聚焦多为 12-bit），不要在分析前转 8-bit，会丢失动态范围
- 未压缩原始图片：避免用 PowerPoint 或 Word 处理图片，会压缩和改变像素值
- 采集参数一致：同一批次比较的图像必须用相同激光功率、增益、曝光时间采集
- 避免饱和：荧光过强导致像素饱和，定量偏低。采集时确保最大荧光强度 <4095（12-bit）或 <255（8-bit）
- 共定位物理意义：Pearson R 仅反映线性相关，可能高估共定位；Manders 系数更接近真实共定位比例
- ROI 选择规范：所有样本用相同标准选 ROI（如整个细胞、仅胞质或仅核），避免主观偏差
延伸阅读：免疫荧光染色背景高怎么办、共聚焦显微镜信号弱怎么办、ImageJ Western blot 条带灰度定量操作指南、ImageJ 细胞计数操作指南。