概述
细胞计数是细胞培养传代、药物处理和细胞活力检测的基础操作。传统血球计数板人工目视计数存在主观误差大、效率低的问题，而 ImageJ/FIJI 提供两种自动化计数方案：一是手动多点计数（Multi-point Tool / Cell Counter），适用于少量细胞、形态不规则的样本；二是基于阈值的 Analyze Particles 自动计数，适用于细胞分散均匀、对比度高的图像（如 DAPI/Hoechst 染核荧光图、结晶紫染色贴壁细胞）。
本指南适用于贴壁细胞结晶紫染色图像、悬浮细胞涂片或荧光染核图像的计数，不适用于组织切片中复杂形态细胞的精确计数。
软件准备
- 访问 FIJI 官网（https://imagej.net/software/fiji/）下载对应操作系统版本
- FIJI 是 ImageJ 的发行版，预装常用插件，推荐使用
- 解压后启动 ImageJ（Mac）或 ImageJ.exe（Win）
- 若需多类型分类计数，可额外安装 Cell Counter 插件（
Help → Update → Manage Update Sites勾选）
操作步骤
方法一：手动多点计数
适用于细胞数量较少（<500）、形态不规则或密集粘连的样本。
File → Open打开细胞图像Image → Type → 8-bit转灰度Analyze → Tools → Cell Counter（若未安装，可使用 Multi-point Tool 替代）- 弹出 Cell Counter 窗口，点击 Initialize
- 选择计数类型（Type 1、Type 2…），分别代表不同细胞类型（如活/死细胞、不同形态细胞）
- 在图像上点击每个细胞，软件自动编号并累计计数
- 完成后点击 Measure 或 Save Results 导出
方法二：Analyze Particles 自动计数
适用于细胞分散均匀、对比度高的图像（如 DAPI 染核荧光图）。
步骤一：图像预处理
Image → Type → 8-bitProcess → Filters → Median Filter（半径 2 像素）减少噪声- 如需增强对比度：
Process → Enhance Contrast
步骤二：阈值分割
Image → Adjust → Threshold（快捷键Ctrl+Shift+T/ Mac:Cmd+Shift+T）- 勾选 Dark background（如果细胞是亮色，如荧光染核）
- 调节上下滑块使细胞被红色高亮选中
- 选择分割算法：默认 Default；Hoechst 染色可试 Triangle 或 Otsu
- 点击 Apply 生成二值化图像
步骤三：分水岭分割（可选）
若细胞粘连：Process → Binary → Watershed。软件自动在粘连处画分割线。
步骤四：Analyze Particles
Analyze → Analyze Particles：
- Size: 50-Infinity（像素²，按细胞实际大小调整，DAPI 染核一般 50-500）
- Circularity: 0.5-1.0（圆形度，1.0 为完美圆）
- Show: Outlines（显示分割结果便于检查）
- 勾选 Display results、Exclude on edges（排除接触边缘的细胞）
- 点击 OK
步骤五：检查结果
弹出 Results 窗口，每行一个细胞，包含 Area、Mean、Circularity 等参数。同时弹出 ImageJ 窗口显示分割后的轮廓图，便于人工核查分割是否准确。
结果导出
- Results 窗口 →
File → Save As→ .csv 格式 - 用 Excel 打开，行数即细胞总数
- 若分了多类计数，按 Type 列分类汇总
- 计算单位面积细胞数：总细胞数 / 图像面积（用
Analyze → Set Scale设定比例尺后自动算出）
常见问题
背景扣除
Process → Subtract Background（滚动球半径 50 像素）可消除不均匀照明。对自发荧光较强的组织样本尤其重要。
阈值过高或过低
阈值过高导致相邻细胞合并计数，过低导致一个细胞被分成多个。建议在 Threshold 窗口预览红色高亮区域，肉眼对比确认每个细胞只被选中一次。
粘连细胞处理
分水岭算法对中等粘连有效，严重粘连仍需人工修正。可在 Analyze Particles 中设置 Size 上限排除超大颗粒，再手动补数被合并的细胞。
注意事项
- 比例尺设定：用
Analyze → Set Scale输入已知比例尺（如物镜测微尺），结果才能换算成真实面积 - 图片分辨率：每个细胞至少占 100 像素才能可靠计数
- 未压缩原始图片：避免 JPEG 压缩，推荐 TIFF 格式
- 同一批样本相同参数：阈值和 Size 范围在整个实验中保持一致，避免引入系统偏差
- 多种细胞鉴别：若需区分活死细胞，结合台盼蓝或荧光双染，用 Cell Counter 手动分类
- 结果复核：自动计数结果需人工抽查轮廓图，确认分割准确率 >90%
延伸阅读：细胞计数不准确怎么办、ImageJ Western blot 条带灰度定量操作指南、ImageJ 荧光图片分析。