qPCR 相对定量分析方法详解

为什么需要相对定量？

在大多数基因表达研究中，我们关心的是基因表达的相对变化（如处理组相比对照组的表达量变化），而非基因的绝对拷贝数。qPCR 的相对定量方法可以准确比较不同样本间的基因表达差异。

基本原理：Ct 值与模板量的关系

只有在扩增效率接近 100% 时，模板量增加一倍才约对应 Ct 减少 1 个循环。先验证目标和参考扩增反应的效率及特异性，再使用 2^-ΔΔCt。Livak 与 Schmittgen 的原始方法论文给出了该方法的假设和应用边界。

ΔΔCt 方法详解

1. 基本概念

当目标与参考扩增效率足够接近、参考基因在当前样本和处理条件下稳定时，可以按以下步骤计算。Livak 与 Schmittgen；参考基因应先按本实验条件验证。

ΔCt = Ct(目的基因) - Ct(内参基因)
ΔΔCt = ΔCt(处理组) - ΔCt(对照组)
相对表达量 = 2^(-ΔΔCt)

2. 计算步骤

假设我们有：

• 处理组目的基因 Ct = 20
• 处理组内参基因 Ct = 15
• 对照组目的基因 Ct = 22
• 对照组内参基因 Ct = 15

计算过程：

步骤 1: 计算 ΔCt
  处理组 ΔCt = 20 - 15 = 5
  对照组 ΔCt = 22 - 15 = 7

步骤 2: 计算 ΔΔCt
  ΔΔCt = 5 - 7 = -2

步骤 3: 计算相对表达量
  2^(-ΔΔCt) = 2^2 = 4

结论： 在上述效率与参考基因条件得到验证时，处理样本相对对照校准值为 4 倍；这些 Ct 值本身不能证明生物学差异或统计显著性。

参考基因与对照

GAPDH、ACTB、18S rRNA 等只能作为候选，不能按组织名称直接认定适用。检查无模板对照、RT-qPCR 的无逆转录对照、扩增特异性和参考基因稳定性；任一异常时先回到原试剂与仪器 SOP，再解释相对表达量。MIQE 指南要求说明对照、效率及归一化依据。

数据可视化与统计

1. 柱状图展示

建议使用柱状图展示相对表达量，包含标准差或置信区间。

2. 统计检验

• 生物学重复数取决于实验设计、效应大小和分析目标；技术复孔不能充当独立生物学重复。
• 统计方法需与独立样本、配对关系及分布相符，报告样本数、排除依据与误差定义。MIQE 指南要求披露重复和分析方法，并没有通用的固定重复数门槛。

总结

1. 选择稳定的内参基因并验证
2. 验证目标与参考扩增效率足够接近；不满足时不要直接套用 2^-ΔΔCt
3. 设置足够的生物学重复
4. 使用正确的统计方法
5. 报告标准差或置信区间

参考资料

• Livak 与 Schmittgen，Methods (2001)：2^-ΔΔCt 方法的推导、假设与应用。
• Bustin 等，MIQE 指南，Clinical Chemistry (2009)：扩增效率、对照、参考基因和分析报告要求。