qPCR 扩增效率低怎么办：先验证标准曲线再排查引物与模板

先看什么现象

标准曲线斜率可换算扩增效率：E = 10^(-1/斜率) − 1，以百分比表示时乘以 100。以 Bio-Rad 的 qPCR 数据分析建议为例，90%–110% 是常用的优选区间，约对应 -3.6 至 -3.1 的斜率；它是特定验证目标，不是所有实验的普适废弃线。还要一起看各稀释点、重复孔、线性范围、对照和扩增特异性，不能只凭一个效率或 R² 值判定。Bio-Rad 数据分析说明、MIQE 指南

观察 → 检查 → 下一步

其中无模板对照与无逆转录对照的用途不同：前者帮助发现污染或引物二聚体，后者用于 RT-qPCR 排查基因组 DNA 信号。晚 Ct 并不能自动判定为二聚体，需要结合熔解曲线或产物验证。MIQE 指南

优先检查标准曲线

记录标准品来源、稀释倍数、实际加样体积、每点重复数、阈值和线性范围。用系列稀释工具复核配制量，但计算结果不能代替移液记录。Bio-Rad 的数据分析资料要求同时查看斜率、R² 和各点的重复情况；固定的 R² 数字不能代替观察原始数据。Bio-Rad 数据分析说明

若最高或最低浓度点进入非线性区，应按本实验的定量范围重新选择梯度，不把 Ct 35 或 Ct 38 当作所有仪器的统一界限。每次排除点都应记录原因并重新验证。MIQE 指南

梯度可信后再看模板与引物

1. 比较同一模板的适度稀释反应。稀释后表现改善可能提示抑制，但也可能改变输入量和检测下限；需要与阳性、阴性对照一起判断。MIQE précis
2. 对染料法检查熔解曲线；如非特异产物或二聚体明显，先用引物基础检查记录基础指标；二聚体和特异性需另行检查，再做实测验证。MIQE 指南
3. 反应时间、温度、Mg²⁺、ROX 和引物浓度都依赖预混液、仪器及引物。先核对原试剂盒 SOP，不直接套用其他实验的固定配方。MIQE précis

何时暂停定量解释

若标准曲线不稳定、扩增特异性或对照不合格，先解决检测体系，再进行相对或绝对定量。对相对定量，还应核查目标与参考扩增效率及参考基因稳定性；不能用一个看似正常的 2^-ΔΔCt 结果覆盖前面的质量问题。Livak 与 Schmittgen

参考资料

• Bustin 等，MIQE 指南，Clinical Chemistry (2009)：实验对照、扩增效率和数据报告要求。
• Bustin 等，MIQE précis (2010)：检测抑制及优化的实践说明。
• Bio-Rad qPCR Data Analysis：标准曲线斜率、效率和 R² 的厂家分析指引。
• Livak 与 Schmittgen，Methods (2001)：2^-ΔΔCt 方法的效率假设。