Transwell 细胞迁移与侵袭实验完整操作指南

概述

Transwell 实验是利用带微孔滤膜的小室（Insert）检测细胞**迁移（Migration）和侵袭（Invasion）**能力的经典方法。通过在小室上下两层分别放置细胞和趋化因子，观察细胞穿越滤膜的能力，可以量化细胞的运动性。

该方法广泛应用于：

• 肿瘤细胞转移能力评估
• 免疫细胞趋化性研究
• 干细胞迁移潜能分析
• 细胞因子对细胞运动的影响
• 药物对肿瘤转移的抑制效果

基本概念

Transwell 小室结构

┌─────────────────────────────────┐
│        下室（24-well 板）        │
│  ┌───────────────────────────┐  │
│  │   上室（Transwell Insert） │  │
│  │                           │  │
│  │  ┌─── 细胞（上室）─────┐  │  │
│  │  │                     │  │  │
│  │  │  ════ 滤膜 ═══════  │  │  │
│  │  │  （8 μm 微孔）       │  │  │
│  │  │                     │  │  │
│  │  └─────────────────────┘  │  │
│  │                           │  │
│  └───────────────────────────┘  │
│                                 │
│      下室培养基（含趋化因子）     │
└─────────────────────────────────┘

迁移 vs 侵袭：核心区别

简单记忆：

• 迁移 = 细胞”跑步”能力（穿过滤膜但无基质障碍）
• 侵袭 = 细胞”穿墙”能力（需要降解基质才能穿过去）

滤膜孔径选择

实验 SOP

一、材料准备

必需材料

推荐 Transwell 产品

二、侵袭实验：Matrigel 包被（迁移实验跳过此步）

侵袭实验需要在滤膜上表面包被一层 Matrigel，模拟体内的基底膜。

包被步骤

1. Matrigel 4°C 缓慢融化（提前从 -20°C 取出放 4°C 冰箱过夜）
2. 用预冷的无血清培养基按 1:8 稀释 Matrigel（4°C 操作，防止凝固）
3. 每孔加入 50-100 μL 稀释后的 Matrigel（24-well Transwell）
4. 37°C 孵育 4-6 小时（或 4°C 过夜）让 Matrigel 完全凝固
5. 吸去多余液体，用预热的无血清培养基轻轻洗一次
6. 注意：操作全程在 4°C 或冰上进行，防止 Matrigel 提前凝固

⚠️ 注意：Matrigel 含动物来源蛋白，操作时注意污染风险；不同批号 Matrigel 活性差异大，建议固定批号。

三、细胞准备

Transwell 实验对细胞状态要求较高：

细胞处理

1. 细胞饥饿（关键步骤！）：
   - 转染或药物处理的细胞：处理后 24-48 小时
   - 用无血清培养基替换完全培养基
   - 饥饿 12-24 小时（让细胞处于静止状态，排除血清刺激的影响）

2. 细胞消化与计数：
   - 吸去培养基，PBS 洗一次
   - 加胰酶消化（镜下观察细胞变圆即可，不要过度消化）
   - 加含血清培养基终止消化
   - 1,000 rpm, 5 分钟离心收集细胞
   - 用无血清培养基重悬
   - 血球计数板或自动计数器准确计数

3. 稀释到目标浓度：
   - 迁移实验：1-2 × 10⁵ cells/mL
   - 侵袭实验：2-5 × 10⁵ cells/mL（侵袭速度慢，需要更多细胞）

关键参数

为什么要饥饿？ 血清中含有大量生长因子，会刺激细胞非特异性移动。饥饿让细胞进入 G0 期，此时细胞移动更能反映趋化因子的特异性引导作用。

四、正式实验操作

24-well Transwell 板完整操作流程

准备趋化因子（下室）：
1. 下室（24-well 板孔）加入 600-800 μL 完全培养基（含 10% FBS）
   或已知趋化因子（如 100 ng/mL SDF-1α, 50 ng/mL EGF）

放置上室：
2. 将 Transwell Insert 轻轻放入下室，确保膜浸入下室培养基中
   （膜不能有气泡！气泡会阻碍细胞迁移）

接种细胞：
3. 上室加入 100-200 μL 细胞悬液
   - 迁移：1-2 × 10⁴ cells/well
   - 侵袭：2-5 × 10⁴ cells/well
   
4. 轻轻晃动培养板让细胞均匀分布（不要晃到边缘）

孵育：
5. 37°C, 5% CO₂ 培养箱孵育
   - 迁移实验：4-12 小时（不同细胞系差异大）
   - 侵袭实验：16-48 小时

6. 镜下观察上室细胞数量变化：
   - 如果上室细胞明显减少 → 说明迁移/侵袭在进行
   - 不要让所有细胞都迁完（否则计数不准确）
   - 推荐在 30-50% 细胞迁移时停止

时间点优化指南

关键：时间点需要预实验确定，不要生搬硬套文献值！

五、固定与染色

步骤

1. 终止反应：取出上室，弃去上室培养基
2. PBS 轻轻洗上室膜（上下两面各洗一次）
3. 固定：
   - 4% 多聚甲醛（PFA）：室温 15-20 分钟
   - 或甲醇：-20°C 20 分钟
   
4. （可选）PBS 洗 2-3 次去除多余固定液

5. 染色：
   - 0.5% 结晶紫（溶于甲醇或水）：室温孵育 10-15 分钟
   - 或 1 μg/mL DAPI（细胞核染色）：室温 5 分钟
   
6. 冲洗：
   - 蒸馏水或 PBS 轻轻洗去多余染液
   - 用棉签轻轻擦掉上表面未穿膜的细胞（只擦上表面！）
   
7. 晾干：
   - 室温晾干 10-30 分钟

六、结果观察与计数

显微镜观察

穿膜的细胞会在滤膜下表面（靠近下室培养基的一面）。

观察方法：
1. 将上室放在载玻片上（膜面朝下）
2. 低倍镜（4× 或 10×）下观察，找到细胞密集区域
3. 高倍镜（20× 或 40×）下拍照

⚠️ 注意：不要只拍最密的区域！应该随机拍 5-10 个视野，保证代表性

计数方法对比

ImageJ 自动计数流程

1. 图片格式：8-bit grayscale（结晶紫）或 RGB
2. Image → Adjust → Threshold：调整阈值只保留细胞区域
3. Analyze → Analyze Particles：
   - Size: 50-5000（根据细胞大小调整）
   - Circularity: 0.4-1.0（排除碎片）
4. 记录 Count 值
5. 每个样本拍 5 张图片，取平均值
6. 计算每孔总细胞数 = 平均每视野细胞数 × 视野系数

视野系数计算示例：

• 20× 物镜：视野面积 ~0.2 mm²
• 滤膜总面积：33 mm²（24-well Transwell）
• 系数 = 33 / 0.2 = 165
• 总细胞数 = 平均每视野数 × 165

七、数据统计

关键统计指标

对照组设置

Transwell 实验必须设置以下对照组：

常见问题与解决方案

问题清单

特殊细胞类型处理

实验设计进阶

多因子趋化实验

可以在下室同时加多种趋化因子，观察协同/拮抗效应：

分组设计示例（3 因子实验）：
- 对照组：无血清培养基
- FBS 组：10% FBS
- EGF 组：50 ng/mL EGF
- SDF-1α 组：100 ng/mL SDF-1α
- EGF + SDF-1α 组：同时加两种因子

共培养 Transwell

用 Transwell 可以做细胞共培养实验：

• 上室种肿瘤细胞，下室种成纤维细胞
• 观察共培养后肿瘤细胞迁移能力变化
• 不需要细胞直接接触，只通过培养基中的因子互作

药物抑制实验

Transwell vs 其他迁移实验方法

选择建议：

• 第一套实验 → Transwell（成熟、便宜、结果好解释）
• 需要动态观察 → 划痕实验 + Time-lapse 成像
• 高通量筛选 → 基于孔板的 Transwell 自动化计数
• 单细胞追踪 → Microfluidic 或 Time-lapse 显微镜

总结

Transwell 实验成功的关键是六个匹配：

1. 时间匹配：预实验确定最佳孵育时间，不要照搬文献
2. 细胞数匹配：迁移 1-2×10⁴ / 侵袭 2-5×10⁴（24-well）
3. 趋化因子匹配：下室 FBS 浓度 10-15%，或使用纯化趋化因子
4. Matrigel 匹配：侵袭实验需包被，稀释比例和批号固定
5. 饥饿匹配：12-24 小时无血清，避免非特异性刺激
6. 对照匹配：必须有空白对照 + 平行复孔 + （最好）阳性对照

记住：Transwell 实验结果的可信度，90% 来自良好的对照组和复孔。没有空白对照的结果，无法区分”趋化诱导的迁移”和”细胞随机游走”。

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