为什么染色这一步不能省
很多同学 Transwell 实验做完 SOP，最后卡在染色和计数这一步：要么擦膜把细胞全擦掉了，要么染色太深看不清边界，要么计数只数了 1 个视野就出结论，结果重复性极差。
Transwell 结果的定量，本质上是统计穿过滤膜下表面的细胞数。上室的细胞是背景，必须去掉；下表面的细胞才是迁移/侵袭的真实信号。染色的目的有两个：
- 让细胞可见：结晶紫（Crystal Violet）染细胞核，方便在显微镜下计数
- 区分上下表面：通过擦除上表面未迁移的细胞，只保留下表面迁移细胞
染色与计数全流程
固定 → 干燥 → 染色 → 水洗 → 擦膜 → 透明/封片 → 拍照 → 计数一、固定
取出 Transwell 小室，用 PBS 轻轻漂洗 1 次，然后加入 4% 多聚甲醛（PFA）或甲醇固定。
| 固定液 | 浓度 | 时间 | 温度 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|
| 4% PFA（PBS 配制） | 4% | 15-20 min | 室温 | 通用，细胞形态保留好 |
| 甲醇（预冷） | 100% | 5-10 min | -20°C | 快速固定，适合后续结晶紫染色 |
| 冰乙醇（乙醇:冰醋酸 = 3:1） | - | 10 min | 4°C | 染色体固定，较少用于 Transwell |
实操建议：结晶紫染色推荐用甲醇固定，步骤简单且染色背景低。加液时沿上室壁缓慢加入，避免冲掉下表面细胞。
二、干燥
固定后倒掉固定液，室温自然干燥 10-15 min。不要用烤箱烘干，高温会让细胞皱缩变形。干燥的目的是让细胞更好地贴附在膜上，擦膜时不容易被带掉。
三、结晶紫染色
结晶紫是碱性染料，能与细胞核中的酸性物质结合，使细胞核呈紫蓝色。
结晶紫染液配方
| 成分 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 结晶紫粉末 | 0.5 g | 0.5% |
| 无水甲醇 | 20 mL | 20% |
| 双蒸水 | 80 mL | 定容至 100 mL |
配制方法：先用少量甲醇溶解结晶紫粉末，再加水定容，滤纸过滤后室温避光保存，可长期使用。
染色操作
- 向上室加入 500 μL 0.5% 结晶紫染液（24 孔板小室）
- 室温染色 10-20 min
- 用双蒸水或 PBS 浸泡小室 3 次，每次 5 min，洗去多余染液
- 室温干燥
染色时间对照：
| 细胞密度 | 推荐染色时间 | 备注 |
|---|---|---|
| 高（>200 细胞/视野） | 10 min | 染色过深会导致细胞粘连难以分辨 |
| 中（50-200 细胞/视野） | 15 min | 标准条件 |
| 低（<50 细胞/视野） | 20 min | 适当延长，让弱染色细胞可见 |
四、擦膜（最关键的一步）
擦膜是整个定量流程中最容易翻车的步骤。目的是去除上室滤膜表面未迁移的细胞，只保留下表面迁移细胞。
擦膜工具
推荐用湿棉签，不要用干棉签。干棉签容易产生静电，把下表面细胞也吸走。
擦膜步骤
- 用镊子固定小室边缘，保持滤膜水平
- 用湿润的棉签（PBS 浸润后挤干）轻轻擦拭上室膜表面
- 沿一个方向擦拭，力度均匀，不要来回搓
- 换一根新棉签，重复 2-3 次，直到上表面无紫色残留
- 用显微镜快速检查上表面，确认无残留细胞
擦膜力度判断：
| 力度 | 结果 |
|---|---|
| 太轻 | 上表面残留大量细胞，计数虚高 |
| 适中 | 上表面干净，下表面细胞完整保留 |
| 太重 | 下表面细胞被擦破或带走，计数偏低 |
一个实用技巧：擦完后在显微镜下看膜的边缘，如果边缘有一圈紫色细胞，说明擦膜力度合适（边缘细胞通常最难擦也最难迁移，保留下来属正常）。
五、透明与封片（可选）
结晶紫染色后可以直接在显微镜下观察拍照。如果需要长期保存或提高清晰度，可以用甘油或中性树胶封片。
封片时将小室底部膜用刀片切下，膜面朝上放在载玻片上，滴一滴甘油，盖上盖玻片，避免气泡。
拍照策略
拍照是定量的基础，必须保证随机性和覆盖度。
拍照数量
| 小室类型 | 推荐拍照视野数 | 备注 |
|---|---|---|
| 24 孔板（6.5 mm 膜） | 5-9 个视野 | 4 个角 + 中心，或九宫格 |
| 12 孔板（12 mm 膜） | 9-16 个视野 | 覆盖中心和周边区域 |
| 6 孔板（24 mm 膜） | 16-25 个视野 | 覆盖整个膜面 |
原则：每个小室至少拍 5 个视野，且必须包含膜中心和边缘。细胞在膜上的分布不均匀，只拍中心会高估，只拍边缘会低估。
放大倍数选择
| 放大倍数 | 适用细胞密度 | 视野数要求 |
|---|---|---|
| 100× | 高（>200/视野） | 5 个视野即可 |
| 200× | 中（50-200/视野） | 5-9 个视野 |
| 400× | 低（<50/视野） | 9 个视野以上 |
定量计数方法
方法一：手动计数
手动计数最准确，但费时。适合细胞数较少（<100/视野）的情况。
操作：
- 在显微镜下用目镜网格或图像软件网格辅助计数
- 只计数完整的紫蓝色细胞核，不计数碎片或模糊团块
- 每个视野记录细胞数，求平均值
- 迁移率 = （实验组平均细胞数 / 对照组平均细胞数）× 100%
方法二：ImageJ 自动计数
细胞数较多时推荐用 ImageJ 自动计数，重复性更好。
ImageJ 计数步骤
- 打开图像：File → Open
- 转灰度：Image → Type → 8-bit
- 增强对比度：Process → Enhance Contrast（勾选 Normalize，Saturated pixels 0.35%）
- 阈值分割：Image → Adjust → Threshold，选择合适的阈值，使细胞核与背景分离
- ** watershed 分割**：Process → Binary → Watershed（分割粘连细胞）
- 粒子分析：Analyze → Analyze Particles
- Size：根据细胞大小设置（如 50-Infinity pixel²）
- Circularity：0.3-1.0
- 勾选 Display results、Summarize、Add to overlay
参数设置参考
| 细胞类型 | 细胞核大小（pixel²） | Circularity |
|---|---|---|
| 肿瘤细胞（大核） | 80-Infinity | 0.4-1.0 |
| 免疫细胞（小核） | 30-Infinity | 0.5-1.0 |
| 成纤维细胞（梭形） | 50-Infinity | 0.2-1.0 |
注意：自动计数前必须在几张代表性图像上与手动计数对比，校准阈值和参数。
常见坑点与避坑
坑 1：擦膜把下表面细胞擦掉了
原因：棉签太干、力度太大、或从下表面方向擦拭。
解决：
- 棉签用 PBS 浸润后挤到半干
- 只擦上表面，不要翻面
- 擦膜后先在低倍镜下检查下表面细胞是否完整
坑 2：染色太深，细胞粘连成块无法计数
原因：染色时间过长，或结晶紫浓度过高。
解决：
- 缩短染色时间至 5-10 min
- 染色后充分水洗，必要时用 75% 乙醇脱色 30 s
- 下次实验降低结晶紫浓度至 0.1%-0.25%
坑 3：上下表面都有细胞，分不清哪些是迁移细胞
原因：擦膜不彻底。
解决：
- 擦膜次数增加到 3-4 次，每次换棉签
- 擦完后用显微镜检查上表面，确认无紫色细胞残留
- 必要时用胰酶消化上表面细胞（37°C 5 min）再擦
坑 4：计数重复性差，组内差异大
原因：拍照视野太少或不随机；细胞接种不均匀。
解决：
- 每个小室至少拍 5 个视野，采用九宫格或随机取样
- 细胞接种时充分吹打均匀，避免局部聚集
- 每个实验组至少设 3 个复孔
坑 5：膜边缘细胞过多，中心细胞少
原因：细胞接种时边缘效应，或趋化因子扩散不均匀。
解决：
- 拍照时包含中心和边缘，按实际比例加权
- 接种细胞后静置 10 min 再放入培养箱，让细胞均匀沉降
- 下室加趋化因子时沿壁缓慢加入，避免产生对流
结果报告规范
迁移/侵袭实验结果建议报告以下内容：
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 复孔数 | ≥3 个/组 |
| 拍照视野数 | ≥5 个/小室 |
| 统计方法 | 多组比较用单因素 ANOVA，两组比较用 t 检验 |
| 数据展示 | 平均细胞数 ± SD，或迁移率 ± SD |
| 图像展示 | 每组至少展示 1 个代表性视野，标注放大倍数 |
| 侵袭能力指标 | 侵袭率 = 侵袭细胞数 / 迁移细胞数 × 100% |
相关阅读
- Transwell 细胞迁移与侵袭实验完整操作指南
- Transwell 迁移实验细胞不迁移怎么办
- 细胞接种密度怎么选
- ImageJ 细胞计数完整教程
- 细胞活性检测方法选择与比较
- 细胞培养污染预防与处理
- 划痕实验 ImageJ 定量分析