为什么需要 Stripping
Western Blot 实验中，一张 PVDF 膜上常常需要检测多个靶蛋白。典型场景：
- 同一样本需要检测 目标蛋白 + 内参（如 GAPDH、β-actin）
- 需要检测 同一通路的多个信号分子（如 p-AKT、total-AKT、p-GSK3β）
- 抗体来源有限或膜上蛋白量少，无法重复跑胶转膜
Stripping 的原理是通过化学试剂破坏抗体-抗原结合，同时尽量保留膜上的蛋白，再用新抗体重新孵育。做不好的话，轻则背景升高，重则蛋白丢失、条带消失。
Stripping 前的判断：哪些膜适合再孵育
适合 Stripping 的场景
| 条件 | 说明 |
|---|---|
| PVDF 膜 | 蛋白结合力强（靠疏水作用），Stripping 后蛋白保留率通常 >80% |
| NC 膜（硝酸纤维素膜） | 蛋白结合靠疏水+静电，Stripping 后保留率略低（~70%），但仍可做 2-3 次 |
| 目标蛋白分子量差异大 | 检测完 100 kDa 蛋白后再检测 20 kDa，信号不会互相干扰 |
| 抗体物种相同或相容性好 | 二抗不会识别上一个一抗 |
不适合 Stripping 的情况
- 目标蛋白分子量相近（<10 kDa 差异）：Stripping 不完全时旧抗体残留会产生干扰条带
- 使用了 PVDF 膜但封闭剂中有高浓度 SDS：会改变蛋白与膜的结合
- 转膜后已经放了 2 周以上：蛋白可能已降解或结合不可逆
- 检测的是超低丰度蛋白（<0.1 pg）：Stripping 过程可能进一步损失信号
经验原则：一张 PVDF 膜建议 Stripping 最多 3 次。超过后蛋白保留率会急剧下降，且背景升高严重。
三种常用 Stripping Buffer 对比
方案一：低 pH Glycine Buffer（最常用）
配方（100 mL）：
| 成分 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| Glycine | 0.75 g | 100 mM |
| SDS | 1 g | 1% (w/v) |
| Tween-20 | 1 mL | 1% (v/v) |
| 蒸馏水 | 至 100 mL | — |
| pH | 调至 2.2 | 用浓 HCl 调节 |
原理：低 pH（2.2）条件下抗体的氢键和静电结合被破坏，SDS 作为去垢剂增加蛋白复合物的溶解度，Tween-20 防止蛋白重新结合到膜上。
适用场景：
- 绝大多数常规 Western Blot
- 对蛋白保留要求高的实验
- 推荐首选方案
方案二：2% SDS + β-巯基乙醇（最强力）
配方（100 mL）：
| 成分 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| SDS | 2 g | 2% (w/v) |
| β-巯基乙醇 (β-ME) | 1 mL | 1% (v/v) |
| 蒸馏水 | 至 100 mL | — |
原理：高浓度 SDS 直接破坏抗体-抗原的疏水结合，β-巯基乙醇还原抗体的二硫键，使抗体结构松散、易于洗脱。
适用场景：
- 某些抗体结合力极强（如单克隆抗体亲和力很高），低 pH Stripping 效果不佳
- 需要彻底去除旧抗体（如检测磷酸化蛋白前需要完全去掉总抗体）
- 注意：此方案蛋白损失率较高（20-30%），只建议用 1 次
方案三：Re-Blot / Mild Stripping（商业化）
商品化 Stripping Buffer（如 Re-Blot Plus Mild Solution、Abcam Stripping Buffer）通常采用 proprietary 配方，特点是：
- 操作更温和，蛋白保留率更高（>90%）
- 背景更低，适合多次 Stripping
- 价格较高
适用场景：
- 珍贵样本（如原代细胞、临床样本）
- 需要 Stripping 3 次以上
- 对背景要求极高的实验
三种方案选择决策树
开始 Stripping
│
├── 首次 Stripping / 常规实验 ──→ 方案一（Glycine Buffer）
│
├── 方案一效果不佳（有残留条带） ──→ 方案二（SDS + β-ME）
│
└── 珍贵样本 / 多次 Stripping ──→ 方案三（商品化 Buffer）完整操作步骤
1. 预处理（Stripping 前）
- 用 TBS-T 洗膜 3 次，每次 5 分钟，彻底去除显影液中的 HRP 底物残留
- 检查膜的方向：剪角标记的一面朝上（蛋白结合面），避免 Stripping 时磨损
- 准备好预冷的 Stripping Buffer，使用前可预热至 37°C（加速反应）
2. Stripping 反应
- 将膜放入杂交袋或合适大小的容器中，加入足够没过膜的 Stripping Buffer
- 37°C 温和孵育 30 分钟，期间可以缓慢振荡（50-60 rpm）
- 每 10 分钟检查一次溶液，若变浑浊（蛋白释放），更换新鲜 Buffer
- 对于方案二（SDS + β-ME），37°C 孵育 15 分钟即可，不要超时
注意：β-巯基乙醇有毒且有挥发性，操作时务必在通风橱内进行。
3. 去除 Stripping Buffer
- 取出膜，用 TBS-T 快速洗 3 次，每次 5 分钟
- 用 TBS（无 Tween）再洗 2 次，去除残留的 SDS 或 Glycine（这些会干扰新的封闭和孵育）
- 此时膜上应该还能看到淡淡的总蛋白条带（丽春红 S 残留），这是正常的
4. 验证 Stripping 效果
方法 A：丽春红 S 染色（推荐）
- 将膜浸入 Ponceau S 染液中 1-2 分钟
- 如果只能看到模糊的总蛋白背景色，说明 Stripping 成功
- 如果仍然能看到清晰的目标蛋白条带，说明 Stripping 不完全，需要重新做
方法 B：用二抗检测
- 跳过封闭步骤，直接用 HRP 标记的二抗孵育 1 小时
- 曝光检测：如果没有任何条带或信号极弱，说明 Stripping 成功
- 如果有强条带，说明旧抗体残留，需要重新 Stripping
5. 重新封闭与孵育
- 封闭：用 5% 脱脂奶粉或 BSA（根据新抗体推荐）在 TBS-T 中室温孵育 1 小时
- 一抗孵育：按新抗体推荐的浓度和温度孵育（4°C 过夜推荐）
- 洗膜：TBS-T 3 次 × 5 分钟
- 二抗孵育：HRP 标记二抗室温孵育 1 小时
- 洗膜：TBS-T 3 次 × 5 分钟
- 显影：ECL 化学发光检测
常见问题与避坑
问题 1：Stripping 后新抗体无信号
原因分析：
- Stripping 过度，蛋白从膜上脱落
- 膜在 Stripping 过程中暴露于高温或低 pH 时间过长
- 目标蛋白本身丰度太低，Stripping 后损失殆尽
解决方案：
- 缩短 Stripping 时间（15 分钟试试）
- 降低 Stripping Buffer 温度（室温代替 37°C）
- 改用更温和的 Stripping 方案（商品化 Buffer）
- 增加新抗体的孵育浓度或时间
问题 2：Stripping 后背景升高
原因分析：
- Stripping Buffer 中的 SDS 残留，破坏了膜的疏水结构
- 封闭不充分，新抗体的非特异结合位点暴露
- 膜 Stripping 次数过多，蛋白不均匀暴露
解决方案：
- Stripping 后用 TBS 充分洗涤（至少 5 次 × 5 分钟）
- 延长封闭时间（1.5-2 小时），或用更高浓度的封闭剂
- 改用 BSA 封闭（对某些抗体背景更低）
- 如果是多次 Stripping，考虑换一张新膜
问题 3：旧抗体条带仍然可见
原因分析：
- Stripping 不完全：孵育时间太短或 Buffer 活性降低
- 抗体结合力过强：某些单抗与抗原结合的 Kd 可达 pM 级
- 膜未充分浸润：Dry PVDF 膜需要先用甲醇活化
解决方案：
- 延长 Stripping 时间至 45-60 分钟
- 更换新鲜 Stripping Buffer
- 改用方案二（SDS + β-ME）
- 确认膜完全浸润（如果使用干转膜，先在甲醇中浸泡 30 秒）
问题 4：不同大小的蛋白检测顺序
建议策略：
- 先检测大蛋白（>80 kDa）：大蛋白在 Stripping 过程中更容易保留
- 后检测小蛋白（<30 kDa）：小蛋白可能在多次 Stripping 中丢失
- 内参通常最后检测：GAPDH 等内参丰度高，即使 Stripping 损失部分也能检测到
实操案例
案例：同膜检测 p-AKT (Ser473)、total-AKT 和 GAPDH
第 1 轮检测： p-AKT (Ser473, ~60 kDa)
- 转膜后用 5% BSA 封闭
- 兔抗 p-AKT (1:1000) 4°C 过夜
- HRP 二抗 (1:5000) 室温 1 小时
- ECL 显影，获得 p-AKT 条带
第 2 轮检测： total-AKT (~60 kDa)
- Glycine Buffer Stripping 37°C × 30 分钟
- 丽春红 S 确认 Stripping 效果
- 5% 脱脂奶粉封闭
- 兔抗 total-AKT (1:2000) 4°C 过夜
- 显影，获得 total-AKT 条带
第 3 轮检测： GAPDH (~37 kDa)
- Glycine Buffer Stripping 37°C × 30 分钟
- 5% 脱脂奶粉封闭
- 兔抗 GAPDH (1:5000) 室温 1 小时
- 显影，获得 GAPDH 条带
关键技巧：p-AKT 和 total-AKT 分子量相同（~60 kDa），但因为使用的抗体一个识别磷酸化位点、一个识别总蛋白，它们在膜上的位置相同。Stripping 必须彻底，否则 total-AKT 检测会受到 p-AKT 抗体残留的干扰。建议在 Stripping 后用二抗预检测确认无残留。
总结：Stripping 操作 Checklist
- 确认膜类型（PVDF 推荐，NC 可接受）
- TBS-T 预洗膜 3 次
- 选择合适的 Stripping Buffer（首次用 Glycine，后续用 SDS+β-ME）
- 37°C 孵育，温和振荡
- TBS-T 洗 3 次，TBS 洗 2 次
- 丽春红 S 验证 Stripping 效果
- 重新封闭，避免背景升高
- 按大蛋白→小蛋白顺序检测
Stripping 是一项需要耐心的技术。一次做好可以节省大量时间和样本，做得不好反而浪费更多时间在排查问题上。掌握好三种 Buffer 的选择和操作细节，就能稳定地在同一张膜上获得多个靶蛋白的高质量数据。