快速排查指南
使用此表格快速定位和解决 Western blot 实验中的问题。
无信号问题
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|
| 整张膜无信号 | 抗体问题 | 更换抗体或增加浓度 |
| 底物失效 | 使用新鲜底物 |
| 蛋白未转膜 | 检查转膜效率，可用 Ponceau 染膜 |
| 蛋白未上样 | 确认上样量，检查 loading |
| 单个泳道无信号 | 该样品无目标蛋白 | 阳性对照验证 |
| 蛋白降解 | 添加蛋白酶抑制剂 |
条带问题
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|
| 条带模糊 | 蛋白降解 | 使用新鲜样本，添加蛋白酶抑制剂 |
| 电泳时间过长 | 调整电泳条件 |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体浓度 |
| 封闭不足 | 增加封闭时间或浓度 |
| 多条非特异性条带 | 抗体不特异 | 更换抗体 |
| 一抗浓度过高 | 增加稀释倍数 |
| 二抗非特异性 | 二抗设对照，更换二抗 |
| 条带拖尾 | 蛋白量过多 | 减少上样量 |
| 抗体过高 | 降低抗体浓度 |
| 胶浓度不对 | 选择合适的胶浓度 |
背景问题
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|
| 整体背景高 | 封闭不足 | 增加封闭时间或浓度 |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体浓度 |
| 洗涤不充分 | 增加洗涤次数和时间 |
| 底物过多 | 减少底物用量 |
| 局部背景高 | 膜干燥 | 保持膜湿润 |
| 抗体孵育不均 | 摇床上孵育 |
| 气泡 | 赶出气泡 |
电泳与转膜问题
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|
| 条带歪斜 | 胶聚合不均 | 使用新鲜胶，确保聚合完全 |
| 上样歪斜 | 垂直上样 |
| 电压过高 | 降低电压 |
| 条带微笑形 | 电压过高 | 降低电压 |
| 电泳 buffer 问题 | 使用新鲜 buffer |
| 转膜不完全 | 转膜时间短 | 增加转膜时间 |
| 转膜电压低 | 提高转膜电压 |
| 膜与胶接触不良 | 确保无气泡 |
| 转膜失败 | 方向错误 | 确认正负极方向 |
| buffer 问题 | 使用新鲜转膜 buffer |
其他问题
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|
| 膜上有沉淀 | 抗体聚集 | 过滤或离心抗体溶液 |
| 奶粉沉淀 | 使用新鲜奶粉溶液 |
| 缓冲液盐浓度高 | 透析或稀释样品 |
| 泳道变形 | 上样体积过大 | 减少上样体积 |
| 样品盐浓度高 | 减少样品盐浓度 |
实验流程检查清单
每次实验前确认以下要点：
样本处理
电泳
转膜
抗体孵育
检测
本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。
