阳性对照转染正常时，问题集中在目的质粒本身。
适用场景
遇到以下现象时，建议按下面的排查顺序逐步缩小范围，而不是一次性同时调整多个变量。
- 荧光阳性率 <50%
- qPCR/WB 检测不到外源表达
- 脂质体转染效果差
- 病毒感染后几乎无阳性
01
先用阳性对照验证整体系统
GFP/报告基因的阳性对照是否成功表达，至少 4 个对照孔都设置了吗？
阳性对照也失败，直接说明转染系统级故障，不要排查目的基因。
可能原因
- 对照设置不完整
- 阳性对照质粒过期
- 读板/荧光设置错误
推荐处理方式
- 设置空白/试剂/空载体/阳性四组对照
- 用 GFP 质粒做系统测试
- 复核荧光/发光检测参数
02
检查细胞状态与接种密度
转染前细胞活率 >95%？转染时融合度 60–80%？代次是否 <30 代？
细胞状态健康，继续看质粒和试剂。
细胞状态差或密度错，是最常见的转染效率低原因。
可能原因
- 细胞活率不足
- 融合度过高或过低
- 支原体污染
- 代次过老
推荐处理方式
- 转染前 18–24 h 按 60–80% 融合铺板
- 从种子库复苏低代次细胞
- 做支原体 PCR 检测
03
复核质粒质量和定量准确性
A260/280 1.80–1.95？A260/230 >2.0？超螺旋 >80%？内毒素 <1 EU/μg？
质粒质量合格，继续看转染试剂和条件。
90% 的新手转染失败，质粒质量不合格是隐形主因。
可能原因
- A260/230 低（盐/酒精残留）
- 超螺旋不足 <50%
- 内毒素超标 >1 EU/μg
- 定量虚高（RNA/蛋白污染）
推荐处理方式
- 用 EndoFree 去内毒素试剂盒重提
- 重新乙醇沉淀 + 70% 乙醇洗 2 次
- 跑 0.8% 琼脂糖凝胶看超螺旋比例
- 用 Qubit（荧光法）复核浓度
04
优化转染试剂 : 质粒比例矩阵
试剂:DNA 比例是否做过 3×3 梯度？复合物在无血清 Opti-MEM 中孵育 10–20 min？
比例矩阵做过且能找到合适条件，继续看孵育与换液。
比例不当：要么转不进去（比例太低），要么全死（比例太高）。
可能原因
- 试剂比例过高毒性大
- 试剂比例过低复合物不足
- 在含血清培养基中混复合物
- 孵育 <5 min 或 >30 min
推荐处理方式
- 首次优化必做 3×3 试剂:DNA 比例矩阵
- 用无血清 Opti-MEM 稀释，分别稀释后再混
- 室温孵育 10–20 min 再加入孔板
- 参考不同细胞的推荐起始比例
05
调整转染后换液与检测时间
转染后 4–8 h 是否需要换液？检测时间是否对应 mRNA/蛋白/荧光？
时间点正确时，再评估是否需要更换转染方法。
检测过早在蛋白表达之前，或转染毒性累积未换液都会造成假阴性。
可能原因
- 检测时间过早
- 脂质体孵育过夜不加换液
- 细胞类型选错转染方法（如原代仍用脂质体）
推荐处理方式
- mRNA 检测 6–24 h、蛋白检测 24–72 h、荧光 24–48 h
- 敏感细胞转染 4–8 h 换预热完全培养基
- 原代/干细胞/难转细胞改用电转或病毒
复制排查清单
勾选已经完成的步骤后，可以复制一份文字版排查记录，用于实验记录或发给同事复核。
排查清单预览