CCK-8 检测原理
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是目前最常用的比色法细胞活力检测试剂盒，基于 WST-8 显色原理：
- WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐） 是一种水溶性四唑盐
- 在活细胞线粒体中的脱氢酶作用下，WST-8 被还原为橙色的甲瓒产物（Formazan）
- 甲瓒在 450 nm 处有最大吸收峰，吸光度（OD 值）与活细胞数量在一定范围内呈正比
核心优势：
- 一步法：直接加试剂，不需要吸出上清（MTT 需要吸上清加 DMSO 溶解甲瓒结晶，操作繁琐、易丢细胞）
- 对细胞毒性低：加完读板后甚至可以继续放回培养箱培养（但不推荐重复检测）
- 灵敏度高：1000 个细胞 / 孔就能检测，线性范围 500–100,000 个细胞
- 稳定性好：显色后 1–4 h 内 OD 变化很小，不用急着读板
和同类试剂盒对比
| 方法 | 底物 | 产物 | 波长 | 需要吸出上清？ | 操作难度 | 灵敏度 | 价格 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CCK-8（WST-8） | WST-8 | 橙色甲瓒（水溶） | 450 nm | ❌ 不用 | 最简单 | 高 | 较贵 |
| MTT | MTT | 蓝紫色结晶（不溶） | 570 nm | ✅ 必须 DMSO 溶结晶 | 繁琐 | 中 | 便宜 |
| MTS | MTS + PMS | 棕黄色（水溶） | 490 nm | ❌ 不用 | 简单 | 中高 | 中 |
| XTT | XTT | 橙黄色（水溶） | 450 nm | ❌ 不用 | 简单 | 中 | 中 |
| LDH | LDH 释放 | 红色甲瓒（水溶） | 490 或 450 nm | ❌ 不用 | 简单 | 中 | 中 |
| SRB | 磺酰罗丹明 B 结合蛋白 | 粉红色 | 515 nm | ✅ TCA 固定、洗板 | 繁琐 | 很高 | 便宜 |
综合操作便利 + 灵敏度 + 无有机溶剂，CCK-8 是目前最通用的首选。
实验操作完整流程
第 0 步：预实验确定细胞接种量
这一步跳过的话，正式实验的 OD 值大概率在线性范围外。不同细胞系的代谢活性差异巨大：
- 代谢活跃的肿瘤细胞（HeLa、HepG2）：5000 个/孔孵育 1–2 h 就能到 1.0 OD
- 代谢慢的原代细胞 / 免疫细胞：20000 个/孔孵育 4 h 可能才 0.5 OD
预实验做法：按梯度铺细胞（1000 / 3000 / 5000 / 10000 / 20000 / 40000 个/孔 × 3 复孔），正常培养 24 h（正式实验最终时间点），然后做 CCK-8，选 OD 在 0.8–1.5 之间的密度作为正式实验的接种密度。
经验参考：96 孔板贴壁细胞通常 3000–8000 个/孔（培养 24 h），具体视细胞大小和代谢活性调整。
第 1 步：细胞准备与铺板
- 用胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，计数（血球计数板或计数仪）
- 细胞活率 > 90%，否则死细胞比例过高会严重影响结果
- 悬液要均匀，计数前后都反复吹打避免细胞沉降
- 按预实验确定的密度配制细胞悬液（通常 50,000–200,000 个/mL，每孔加 100 µL）
- 96 孔板加样：
- 边缘效应：最外圈 36 个孔（A1–H1、A12–H12、B1–G1、B12–G12）不要放样本，只加 100 µL PBS 或培养基，作为”防蒸发墙”减少边缘孔培养基蒸干导致的 OD 偏差
- 每组至少 3–5 复孔（4 复孔是期刊要求下限）
- 加样用排枪，尽量在 3 min 内完成，避免前面的孔细胞已经沉降
- 加完后不要晃动板子（容易把细胞甩到孔中心聚成一团），直接平稳放入培养箱
计数不准是 CV 高的头号元凶。细胞计数方法可参考 细胞计数不准怎么办。
第 2 步：药物处理 / 实验干预
如果是药物梯度实验：
- 配制 2× 浓度的药物工作液（因为最终每孔还要加 100 µL，体系变成 200 µL）
- 用培养基做梯度稀释（建议至少 6 个梯度，2–3 倍稀释）
- 每孔加 100 µL 工作液，最终培养基总体积 200 µL / 孔
- 如果用了溶剂（DMSO），设置溶剂对照组（如 0.1% DMSO），确认溶剂本身不影响细胞活力
- 培养箱孵育（通常 24 h / 48 h / 72 h 三个时间点）
第 3 步：加 CCK-8 试剂
这一步操作影响 OD 重复性。建议：
- 提前 30 min 把 CCK-8 试剂盒从 4°C 拿到室温平衡（低温试剂加到 37°C 的培养基里，会在孔板上产生冷凝水珠，影响加样精度）
- 配制”培养基 + 10% CCK-8”工作液：例如每孔 200 µL 培养基，加 20 µL CCK-8 原液（比例 1:10，标准比例）
- 不要直接加 CCK-8 原液到孔里！原液是高浓度液体，直接加在少量孔会导致反应不均匀
- 用排枪每孔加 20 µL CCK-8 工作液（或按上面比例实际量）
- 加完后板子在台面上顺时针轻轻画圈摇匀（不要剧烈晃动，避免溅到隔壁孔或盖子内侧）
- 放回培养箱 37°C 继续孵育
第 4 步：孵育时间的选择
标准孵育时间：1–4 h。
- 如果细胞多、代谢活跃，1 h OD 可能就达到 1.5 以上，立刻读板
- 如果细胞少，孵育 4 h 再看
- 不要孵育过夜（>12 h），WST-8 被耗完或副产物干扰后，颜色不再线性，数据无效
第 5 步：酶标仪读板
- 读板前拿出培养箱，室温放置 5 min（避免 37°C 板在检测窗口起雾，影响光路）
- 打开酶标仪软件，设置：
- 波长模式：单波长 450 nm
- 参考波长：600 nm 或 630 nm（可选，扣除孔底划痕和细胞碎片的浊度，强烈建议加上）
- 读板方式：Bottom-read（底部读取，96 孔板标准），10 次读数 / 孔取均值
- 将板放入酶标仪（注意方向，A1 孔对齐机器的 A1 标记）
- 读板，导出数据（通常是 Excel / CSV）
必须设置的对照组
| 对照组 | 作用 | 内容 |
|---|---|---|
| Blank（空白） | 扣除培养基 + CCK-8 的本底吸光度 | 无细胞的培养基 100 µL + CCK-8 20 µL，同样孵育 |
| Control（阴性对照） | 作为 100% 活力的基准 | 只加细胞和溶剂（如 0.1% DMSO），不加药 |
| Positive Control（阳性对照） | 确认细胞确实能响应（可选） | 加一个已知毒性的药物（如 10% DMSO 或 1 mM H₂O₂），理论存活率 <30% |
| 最大死亡对照 | 计算细胞毒性百分比（LDH 检测时更常用） | 用 1% Triton X-100 裂解全部细胞，做最大 LDH 释放（CCK-8 不需要） |
数据处理与计算
1. 扣空白
把所有复孔的原始 OD 减去 Blank 孔的平均 OD：
Corrected OD = Raw OD − Mean Blank OD
2. 计算相对细胞活力（%）
以 Control 组为 100% 基准：
Cell Viability (%) = Corrected OD_drug ÷ Corrected OD_control × 100%
3. 计算细胞毒性（%，可选）
细胞毒性（%）= 100% − Cell Viability (%)
或当你有最大死亡对照时：
Cytotoxicity (%) = (OD_sample − OD_control) ÷ (OD_max_death − OD_control) × 100%
4. 复孔变异系数 CV
CV (%) = (STD of replicate OD ÷ Mean of replicate OD) × 100%
- CV <5%：优秀，操作过关
- 5%–10%：合格，可接受
- CV >15%：不合格，分析结果不可信，必须排查原因或重做
常见异常与排查
1. OD 值太低（对照组 < 0.3）
| 可能原因 | 解决 |
|---|---|
| 细胞太少 | 增加铺板密度（翻倍），或延长 CCK-8 孵育时间（1 h → 3 h） |
| 细胞活力太差（>30% 死细胞） | 重新复苏状态好的细胞，或先做 Annexin V 确认存活率 |
| CCK-8 加样比例不对（加了 1:20 而不是 1:10） | 检查原液体积 |
| 读板波长选错（选了 570 nm 或 595 nm） | 重新设为 450 nm |
| 加了 CCK-8 但未放回培养箱孵育 | 放回 37°C 继续孵育 1–2 h 再读 |
| 细胞在铺板后大量死亡脱落（药物 / 操作毒性） | 显微镜下观察细胞形态 |
2. OD 值太高（>3.0，超线性）
| 可能原因 | 解决 |
|---|---|
| 细胞太密 | 降低接种量（密度减半），或孵育时间缩短（4 h → 1 h） |
| CCK-8 孵育时间太长 | 缩短到 30–60 min 重测 |
| 酶标仪检测范围上限不够 | 大多数酶标仪 OD 线性上限 ≈ 2.5，>3.0 已不准，不能按实测值除以某个系数估算，必须稀释或调整密度重测 |
3. 复孔 CV > 15%（差异大）
头号常见问题，按优先级排查：
-
加样不均（最常见 80% 的原因）
- 排枪枪头不配套（漏气）→ 换原装枪头
- 加样过程中细胞悬液发生沉降 → 每加 3 排，悬液重新吹打均匀一次
- 加样时贴壁高度不一致，液体流入孔的速度不同 → 排枪贴孔壁同高度加样，枪头不碰液面
-
边缘孔蒸发（Edge effect）
- 外圈孔 OD 整体偏低 → 外圈孔只加 PBS 做防蒸发，样本放内圈 60 孔
-
消化过度细胞破碎死亡不均
- 胰酶时间过长，不同孔细胞存活差异 → 减少消化时间；做细胞活率计数再铺板
-
板子晃动导致细胞分布不均
- 铺完后晃板方式错误（左右晃导致细胞跑到孔中央聚团）→ 画圈缓慢摇匀（幅度小），或直接静置孵育
-
枪头 / 孔污染
- 重复使用枪头或枪头盒没灭干净 → 新盒无菌枪头；每孔单独操作不碰孔壁
4. 空白孔 OD 也很高（>0.3）
- CCK-8 试剂本身被污染（长菌）→ 换新批次试剂
- 96 孔板材质有紫外吸收 → 换品牌板；用参考波长（600 nm）双波长扣除
- 加 CCK-8 时排枪带入气泡导致浑浊 → 加样速度放慢，检查枪头是否有气泡
5. 阳性对照（应该死的）仍然存活 >70%
- 药物降解 / 浓度不够 → 重新配制或提高浓度（如 10–20% DMSO 作为死亡对照）
- 细胞对药物耐受 → 换一种作用机理不同的阳性药物（如紫杉醇）
- 培养时间太短 → 24 h 改成 48 h 观察
6. 某一孔 OD 特别异常（是其他复孔的 2 倍 / 0 倍）
通常是操作失误：这孔加样时细胞悬液加多了、没加 CCK-8、加了两次 CCK-8，或读板时光路有气泡 / 孔底有划痕。统计分析时可以用 Grubbs 检验剔除异常值，但注意最多一孔/组不能超过 1 个，而且必须在方法中写明用什么标准剔除的。
IC₅₀ 的计算方法
拿到药物梯度数据后，GraphPad 计算 IC₅₀：
- 新建 XY 数据表：X = 药物浓度（µM，对数坐标），Y = 细胞活力（%）
- 每组 3–5 个复孔录入
- Analyze → Nonlinear regression (curve fit) → Dose-Response - Inhibition → log(inhibitor) vs. normalized response - Variable slope（Hill equation 四参数拟合）
- 拟合结果中直接输出 IC₅₀（药物浓度的对数再反对数回去即实际浓度）
- 输出参数：R²（>0.95 合格）、HillSlope（通常接近 1，>2 说明协同效应）
CCK-8 无信号 / OD 过低的进一步排查可参考 CCK-8 和 MTT 完全无显色怎么排查。