CCK-8 检测原理
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是目前最常用的比色法细胞活力检测试剂盒，基于 WST-8 显色原理：
- WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐） 是一种水溶性四唑盐
- 在活细胞脱氢酶作用下，WST-8 被还原为橙色的甲瓒产物（Formazan）
- 通常在 450 nm 读取吸光度。信号反映细胞脱氢酶活性；只有在所用细胞、处理条件和接种范围经过验证时，才能用它近似比较活细胞数量
核心优势：
- 一步法：直接加试剂，不需要吸出上清（MTT 需要吸上清加 DMSO 溶解甲瓒结晶，操作繁琐、易丢细胞）
- 对细胞毒性低：加完读板后甚至可以继续放回培养箱培养（但不推荐重复检测）
- 操作简便：试剂盒说明通常要求将 CCK-8 原液直接加入培养孔；最低可检细胞数、信号线性范围和读数时间取决于细胞类型及试剂盒
和同类试剂盒对比
| 方法 | 底物 | 产物 | 波长 | 需要吸出上清？ | 操作难度 | 灵敏度 | 价格 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CCK-8（WST-8） | WST-8 | 橙色甲瓒（水溶） | 450 nm | ❌ 不用 | 最简单 | 高 | 较贵 |
| MTT | MTT | 蓝紫色结晶（不溶） | 570 nm | ✅ 必须 DMSO 溶结晶 | 繁琐 | 中 | 便宜 |
| MTS | MTS + PMS | 棕黄色（水溶） | 490 nm | ❌ 不用 | 简单 | 中高 | 中 |
| XTT | XTT | 橙黄色（水溶） | 450 nm | ❌ 不用 | 简单 | 中 | 中 |
| LDH | LDH 释放 | 红色甲瓒（水溶） | 490 或 450 nm | ❌ 不用 | 简单 | 中 | 中 |
| SRB | 磺酰罗丹明 B 结合蛋白 | 粉红色 | 515 nm | ✅ TCA 固定、洗板 | 繁琐 | 很高 | 便宜 |
综合操作便利 + 灵敏度 + 无有机溶剂，CCK-8 是目前最通用的首选。
实验操作完整流程
第 0 步：预实验确定细胞接种量
不同细胞类型和处理条件下，同样的细胞数可能产生不同信号。先做接种量与显色时间梯度，确认扣空白后的读数随接种量变化，且没有达到酶标仪或试剂盒的测量上限。
预实验做法：在试剂盒建议的范围内按梯度铺细胞，例如 1000 / 3000 / 5000 / 10000 / 20000 个/孔并设置复孔；培养到正式实验的检测时间点，再按同一流程测量。选择能区分处理组、且仍处于本次实验验证的线性区间的接种量，不把固定 OD 区间当成所有细胞的合格标准。
Dojindo CCK-8 说明书给出 96 孔板贴壁细胞至少约 1000 个/孔、建议上限 25000 个/孔的参考值；其他品牌和细胞类型应以所用试剂盒说明及预实验为准。
第 1 步：细胞准备与铺板
- 用胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，计数（血球计数板或计数仪）
- 细胞活率 > 90%，否则死细胞比例过高会严重影响结果
- 悬液要均匀，计数前后都反复吹打避免细胞沉降
- 按预实验确定的密度配制细胞悬液（通常 50,000–200,000 个/mL，每孔加 100 µL）
- 96 孔板加样：
- 边缘效应：最外圈 36 个孔（A1–H1、A12–H12、B1–G1、B12–G12）不要放样本，只加 100 µL PBS 或培养基，作为“防蒸发墙”减少边缘孔培养基蒸干导致的 OD 偏差
- 每组设置生物学重复和技术复孔，数量在实验设计前确定；技术复孔不能替代独立生物学重复
- 加样用排枪，尽量在 3 min 内完成，避免前面的孔细胞已经沉降
- 加完后不要晃动板子（容易把细胞甩到孔中心聚成一团），直接平稳放入培养箱
计数不准是 CV 高的头号元凶。细胞计数方法可参考 细胞计数不准怎么办。
第 2 步：药物处理 / 实验干预
如果是药物梯度实验：
- 配制 2× 浓度的药物工作液（因为最终每孔还要加 100 µL，体系变成 200 µL）
- 用培养基做梯度稀释（建议至少 6 个梯度，2–3 倍稀释）
- 每孔加 100 µL 工作液，最终培养基总体积 200 µL / 孔
- 如果用了溶剂（DMSO），设置溶剂对照组（如 0.1% DMSO），确认溶剂本身不影响细胞活力
- 培养箱孵育（通常 24 h / 48 h / 72 h 三个时间点）
第 3 步：加 CCK-8 试剂
这一步操作影响 OD 重复性。建议：
- 按所用试剂盒说明处理和保存试剂，使用前让各孔试剂温度与加样顺序保持一致
- 将 CCK-8 原液直接加入已有培养基的孔中。Dojindo CK04 说明书的 96 孔板示例为每孔 100 µL 培养基加 10 µL 原液；若每孔已有 200 µL 培养基，按同一 1:10 加量原则应加 20 µL 原液，但仍以所用品牌说明为准
- 不要先把原液稀释成“工作液”，再只取 10 或 20 µL 加入孔中；那会使实际试剂量低于上述示例。用排枪加样时避免气泡，并保证各孔顺序和混匀方式一致
- 轻柔混匀，避免液体飞溅或形成气泡
- 放回培养箱 37°C 继续孵育
第 4 步：孵育时间的选择
上述 Dojindo 说明书的参考孵育时间是 1–4 h。按预实验选择能够分辨各组、又未超出已验证线性范围的时间；不同细胞和试剂盒不应共用一个固定读数时间。超过说明书推荐时间的实验需重新验证，不能直接沿用已有标准曲线。
第 5 步：酶标仪读板
- 按所用酶标仪说明处理孔板，检查孔内是否有气泡，并对所有组使用相同读板条件
- 打开酶标仪软件，设置：
- 波长模式：单波长 450 nm
- 参考波长：若样品浑浊，可按试剂盒和仪器说明测量 600 nm 或更高波长并扣除背景
- 读板方式：遵循酶标仪与孔板的兼容设置，并在各组保持一致；不要假定所有仪器都应使用底部读取
- 将板放入酶标仪（注意方向，A1 孔对齐机器的 A1 标记）
- 读板，导出数据（通常是 Excel / CSV）
必须设置的对照组
| 对照组 | 作用 | 内容 |
|---|---|---|
| Blank（空白） | 扣除培养基、处理物和 CCK-8 的本底吸光度 | 无细胞，但培养基、溶剂/处理物、总体积和 CCK-8 原液加量均与对应样品孔相同；例如 200 µL 培养基 + 20 µL 原液 |
| Control（阴性对照） | 作为 100% 活力的基准 | 只加细胞和溶剂（如 0.1% DMSO），不加药 |
| Positive Control（阳性对照） | 验证检测体系能响应预期处理（按实验目的设置） | 使用对当前细胞和时间点已验证的处理条件，不预设统一的致死浓度或存活率 |
数据处理与计算
1. 扣空白
把所有复孔的原始 OD 减去 Blank 孔的平均 OD：
Corrected OD = Raw OD − Mean Blank OD
2. 计算相对细胞活力（%）
以 Control 组为 100% 基准：
Cell Viability (%) = Corrected OD_drug ÷ Corrected OD_control × 100%
3. 计算细胞毒性（%，可选）
可以报告相对于对照组的活力下降幅度 100% − Cell Viability (%)，但这不是 LDH 释放率，也不能单凭 CCK-8 区分细胞死亡、增殖受抑或代谢活性变化。不要把 LDH 的“最大释放对照”公式套用到 CCK-8 读数。
4. 复孔变异系数 CV
CV (%) = (STD of replicate OD ÷ Mean of replicate OD) × 100%
CV 可用来发现技术复孔离散，但没有适用于所有细胞、处理条件和读数范围的统一合格阈值。实验前设定复核标准，并同时检查孔板位置、空白扣除、细胞状态和原始读数；不要只凭一个 CV 数值删除复孔。
常见异常与排查
1. 扣空白后信号接近背景
| 可能原因 | 解决 |
|---|---|
| 细胞太少 | 增加铺板密度（翻倍），或延长 CCK-8 孵育时间（1 h → 3 h） |
| 细胞活力太差（>30% 死细胞） | 重新复苏状态好的细胞，或先做 Annexin V 确认存活率 |
| CCK-8 原液加量不足或被重复稀释 | 对照所用试剂盒说明，核对每孔培养基和原液体积 |
| 读板波长选错（选了 570 nm 或 595 nm） | 重新设为 450 nm |
| 加了 CCK-8 但未放回培养箱孵育 | 放回 37°C 继续孵育 1–2 h 再读 |
| 细胞在铺板后大量死亡脱落（药物 / 操作毒性） | 显微镜下观察细胞形态 |
2. OD 值接近仪器上限或不再随细胞数线性增加
| 可能原因 | 解决 |
|---|---|
| 细胞太密 | 降低接种量（密度减半），或孵育时间缩短（4 h → 1 h） |
| CCK-8 孵育时间太长 | 缩短到 30–60 min 重测 |
| 超出所用酶标仪或试剂盒的线性范围 | 对照仪器规格并重做接种量/显色时间梯度；不能用任意系数把饱和读数换算成有效结果 |
3. 复孔差异明显
头号常见问题，按优先级排查：
-
加样不均
- 排枪枪头不配套（漏气）→ 换原装枪头
- 加样过程中细胞悬液发生沉降 → 每加 3 排，悬液重新吹打均匀一次
- 加样时贴壁高度不一致，液体流入孔的速度不同 → 排枪贴孔壁同高度加样，枪头不碰液面
-
边缘孔蒸发（Edge effect）
- 外圈孔 OD 整体偏低 → 外圈孔只加 PBS 做防蒸发，样本放内圈 60 孔
-
消化过度细胞破碎死亡不均
- 胰酶时间过长，不同孔细胞存活差异 → 减少消化时间；做细胞活率计数再铺板
-
板子晃动导致细胞分布不均
- 铺完后晃板方式错误（左右晃导致细胞跑到孔中央聚团）→ 画圈缓慢摇匀（幅度小），或直接静置孵育
-
枪头 / 孔污染
- 重复使用枪头或枪头盒没灭干净 → 新盒无菌枪头；每孔单独操作不碰孔壁
4. 空白孔 OD 偏高
- CCK-8 试剂本身被污染（长菌）→ 换新批次试剂
- 培养基、溶剂或待测化合物本身显色/还原 WST-8 → 设置与样品组成一致的无细胞空白，并核对试剂盒说明
- 加 CCK-8 时排枪带入气泡导致浑浊 → 加样速度放慢，检查枪头是否有气泡
5. 预期降低信号的阳性处理未见响应
- 处理物降解、浓度或处理时间不合适 → 核对配制记录，使用已验证的阳性处理条件
- 细胞对药物耐受 → 换一种作用机理不同的阳性药物（如紫杉醇）
- 培养时间太短 → 24 h 改成 48 h 观察
6. 某一孔 OD 特别异常（是其他复孔的 2 倍 / 0 倍）
先检查原始记录：是否漏加或重复加入细胞/CCK-8、孔内是否有气泡、孔底是否有划痕。不要仅因读数偏离就删除复孔；若确有预先规定的异常值处理规则，应保留原始数据并记录原因。
IC₅₀ 的计算方法
拿到药物梯度数据后，GraphPad 计算 IC₅₀：
- 新建 XY 数据表：X = 药物浓度（µM，对数坐标），Y = 细胞活力（%）
- 每组 3–5 个复孔录入
- Analyze → Nonlinear regression (curve fit) → Dose-Response - Inhibition → log(inhibitor) vs. normalized response - Variable slope（Hill equation 四参数拟合）
- 拟合结果中直接输出 IC₅₀（药物浓度的对数再反对数回去即实际浓度）
- 检查拟合曲线是否覆盖上下平台、各浓度复孔离散程度和参数区间；不要用固定 R² 或 HillSlope 阈值代替实验设计和拟合诊断
CCK-8 无信号 / OD 过低的进一步排查可参考 CCK-8 和 MTT 完全无显色怎么排查。
参考资料
- Dojindo Cell Counting Kit-8（CK04）说明书：原液加样比例、孵育与读板、细胞数预实验及还原性物质干扰。不同品牌的产品应以各自说明书为准。
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