为什么必须做单克隆筛选
CRISPR 编辑后的细胞群体是混合克隆，包含：
- 未编辑细胞（野生型）
- 杂合敲除细胞（一条等位基因被编辑）
- 纯合敲除细胞（两条等位基因都被编辑）
- 不同 indel 类型的细胞
- 脱靶编辑的细胞
Bulk 细胞直接做 Western blot 或功能实验，结果会被未编辑细胞和不同基因型的细胞稀释或掩盖。获得阳性单克隆是后续功能验证的前提。
第一步：编辑后细胞的初步扩增
1.1 编辑后多久开始筛选
| 转染方式 | 建议检测起始时间 | 开始单克隆筛选时间 |
|---|---|---|
| 质粒转染 | 48-72 h | 72-96 h |
| 慢病毒感染 | 72-96 h | 96-120 h |
| RNP 电转 | 48-72 h | 72-96 h |
原则：等细胞从转染应激中恢复、基因型稳定后再开始筛选。太早筛选细胞状态差，存活率低。
1.2 是否需要先加药筛选
如果转移载体带有抗性基因（如 puromycin、blasticidin），可以先加药筛选 3-5 天，富集转染成功的细胞，再挑单克隆。
| 抗生素 | 常用筛选浓度 | 维持浓度 |
|---|---|---|
| Puromycin | 1-2 μg/mL | 0.5-1 μg/mL |
| Blasticidin | 5-10 μg/mL | 2-5 μg/mL |
| G418 | 400-800 μg/mL | 200-400 μg/mL |
注意：加药前必须先做 kill curve，不同细胞敏感性差异很大。
第二步：单克隆分离方法
2.1 有限稀释法
有限稀释法是最经典、最经济的单克隆分离方法。
| 步骤 | 操作要点 |
|---|---|
| 细胞计数 | 台盼蓝计数，确保活率 >90% |
| 稀释 | 用完全培养基稀释至 0.5-1 个细胞/100 μL |
| 铺板 | 96 孔板，每孔 100-150 μL |
| 培养 | 37°C、5% CO2 培养 10-14 天 |
| 观察 | 每天镜下观察，标记只有一个细胞团的孔 |
关键参数：
- 理论密度 0.5 个细胞/孔时，实际约 30% 孔有单克隆
- 若细胞对孤单生长敏感，可加入条件培养基或饲养层细胞
- 每板设置几个 10 个细胞/孔的对照孔，确保培养基和铺板条件没问题
2.2 单细胞分选法
| 方法 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| 流式分选 | 精确，可分选荧光阳性细胞 | 设备要求高，机械应激大 |
| 自动化单细胞铺板 | 效率高，适合大量克隆 | 成本高 |
建议：常规实验室用有限稀释法足够；如果需要挑取特定荧光标记或 surface marker 阳性细胞，用流式分选。
2.3 克隆环法
适用于贴壁细胞，用克隆环套住单个克隆，胰酶消化后转移到新孔扩增。适合已经长成肉眼可见克隆的培养皿，但容易混入相邻克隆。
第三步：单克隆扩增与保种
3.1 扩增流程
- 96 孔板中单个克隆长到 50%-70% 汇合
- 胰酶消化后转移至 24 孔板
- 24 孔板长满后转移至 6 孔板或 35 mm 皿
- 6 孔板长满后一分为二：一份做基因型鉴定，一份继续扩增冻存
3.2 保种时机
| 阶段 | 操作 |
|---|---|
| 24 孔板阶段 | 不要冻存，细胞量太少 |
| 6 孔板阶段 | 可冻存 1-2 管，同时送鉴定 |
| 鉴定阳性后 | 立即大量扩增并冻存多管 |
避坑建议：不要等到鉴定结果才冻存。6 孔板阶段先冻存一管备份，避免后续扩增失败导致克隆丢失。
第四步：基因型鉴定策略
4.1 粗筛：T7E1 或 TIDE
T7E1 可以快速判断单克隆是否被编辑，但不能区分纯合/杂合。
| 结果 | 解读 |
|---|---|
| 两条切割条带 | 该克隆为杂合或双等位基因不同 indel |
| 无切割条带 | 可能为野生型，也可能为纯合敲除 |
| 一条切割条带很弱 | 可能为低比例嵌合 |
TIDE 分析 Sanger 测序峰图可以更准确判断编辑类型和比例，适合批量粗筛。
4.2 金标准：Sanger 测序
每个候选克隆都需要送 Sanger 测序确认具体基因型。
| 测序策略 | 适用情况 |
|---|---|
| 单向测序 | 靶位点附近序列简单，可快速判断 |
| 双向测序 | 靶位点附近有重复序列或套峰复杂 |
| TA 克隆后测序 | 双等位基因不同 indel，需要分开看 |
引物设计要点：
- 引物距离靶位点 150-300 bp
- 产物长度 300-600 bp
- 避免靶位点位于引物结合区
4.3 蛋白水平验证
基因型敲除不等于蛋白完全敲除。必须做 Western blot 或功能实验验证。
| 验证方式 | 说明 |
|---|---|
| Western blot | 直接检测目的蛋白是否消失或截短 |
| qPCR | 检测 mRNA 水平是否下降 |
| 功能实验 | 根据蛋白功能设计，如激酶活性、报告基因 |
注意：
- 抗体可能识别截短蛋白， Western blot 结果要结合基因型解读
- 非编码区编辑可能不影响蛋白表达，必须做功能实验
第五步：常见失败模式与处理
5.1 挑不到单克隆
| 原因 | 处理 |
|---|---|
| 细胞密度太高 | 重新稀释，降低铺板密度 |
| 细胞对孤单生长敏感 | 加条件培养基、饲养层或提高血清浓度 |
| 抗生素浓度过高 | 降低筛选浓度或缩短筛选时间 |
| 细胞状态差 | 检查支原体，换用对数生长期细胞 |
5.2 单克隆都是野生型
| 原因 | 处理 |
|---|---|
| 编辑效率太低 | 优化 sgRNA 或递送系统，先提高 bulk 编辑效率 |
| 铺板太早 | 等 96-120 h 后再筛选 |
| 筛选时丢失编辑细胞 | 不加药筛选，直接有限稀释 |
5.3 双等位基因编辑不同
同一个细胞两条染色体可能产生不同 indel，导致：
- 一条等位基因移码，另一条未移码
- 蛋白表达部分残留
- Western blot 仍有弱条带
处理：对这类克隆做 TA 克隆测序，分别看两条等位基因的基因型，选择双等位都移码或大片段缺失的克隆。
5.4 脱靶编辑
| 风险等级 | 处理 |
|---|---|
| 低 | 挑取 2-3 个独立单克隆做验证，避免脱靶共分离 |
| 中 | 用预测软件筛选潜在脱靶位点，PCR 测序验证 |
| 高 | 换用高保真 Cas9 变体或重新设计 sgRNA |
第六步：克隆鉴定记录表
建议每个克隆建立完整记录：
| 字段 | 内容 |
|---|---|
| 克隆编号 | 如 KO-1、KO-2，按板和孔位命名 |
| 来源 | 哪次编辑、哪个 sgRNA |
| 铺板日期 | 有限稀释日期 |
| 挑克隆日期 | 转移到 24 孔日期 |
| T7E1 结果 | 是否编辑 |
| Sanger 测序结果 | 具体 indel 类型 |
| 蛋白验证结果 | Western blot 或 qPCR |
| 冻存管号 | 备份位置 |
单克隆筛选的完整时间线
| 天数 | 操作 |
|---|---|
| Day 0 | 转染或感染 |
| Day 2-3 | 检测 bulk 编辑效率 |
| Day 3-5 | 如需，加药筛选 |
| Day 5-7 | 有限稀释铺 96 孔板 |
| Day 15-20 | 96 孔板单克隆长到可转移 |
| Day 20-25 | 转移到 24 孔板、6 孔板 |
| Day 25-30 | 提取 DNA，T7E1 / Sanger 鉴定 |
| Day 30-35 | Western blot 验证，阳性克隆扩增冻存 |
避坑建议
-
不要只挑一个克隆：至少挑取并验证 3-5 个独立单克隆，避免脱靶或克隆特异性效应干扰结论。
-
96 孔板铺板后不要频繁移动：机械振动会导致细胞聚集，影响单克隆形成。
-
鉴定引物要跨靶位点两侧：如果只测一侧，可能漏看大片段缺失。
-
注意杂合子的蛋白表达：杂合敲除细胞可能仍有 50% 蛋白表达，功能实验结果会介于野生型和纯合子之间。
-
冻存前确保支原体阴性：支原体污染会让后续所有实验结果不可靠。