RNA 酶污染怎么排查和清除？提取全程防控要点

RNase 污染的表现

RNase 无处不在且极其稳定，耐高温、耐反复冻融，一旦污染 RNA 样品会导致：

• 提取的 RNA 电泳 28S/18S 条带模糊或消失
• RIN 值低于 7，28S/18S 比值小于 1
• RNA 浓度测定正常但下游 RT-PCR 无信号
• 同一操作者提取的 RNA 普遍质量差

关键判断：如果偶尔一次 RNA 降解，更可能是操作失误；如果连续多次提取都降解，基本可以确认是 RNase 污染。

RNase 的四大来源

来源一：操作者（最主要）

人体皮肤、唾液、汗液中含有大量 RNase，是最大的污染源。

来源二：耗材和试剂

非 RNase-free 的离心管、枪头、水、试剂都可能引入 RNase。

来源三：环境

空气中的微生物、灰尘、未清洁的台面都携带 RNase。

来源四：样本本身

组织样本（尤其是胰腺、脾脏）含有丰富的 RNase，裂解不充分会释放内源性 RNase。

排查路径一：操作者防护

检查

• 是否佩戴口罩（唾液飞沫含 RNase）
• 是否佩戴手套并频繁更换
• 是否对着 RNA 操作区域说话
• 是否用裸手接触管口、枪头

处理

• 全程佩戴口罩，不在 RNA 操作区说话
• 佩戴双层手套，外层手套接触污染物后立即更换
• 用 70% 乙醇擦拭手套后再操作
• 长头发束起，避免接触耗材

排查路径二：耗材和试剂

检查

• 离心管和枪头是否为 RNase-free 级别（通常标注 DEPC-treated 或 RNase-free）
• 实验用水是否为 DEPC 处理水或 RNase-free 水
• 试剂配制是否使用 RNase-free 耗材
• 试剂是否长期室温放置

处理

• 使用 commercially certified RNase-free 耗材
• 无法确认的玻璃器皿：180°C 干烤 4 小时
• 无法确认的塑料器皿：0.1% DEPC 水浸泡过夜后高压灭菌
• 配制试剂一律使用 DEPC 处理水或商用 RNase-free 水
• 试剂分装保存，避免反复取用

DEPC 处理方法

1. 在超纯水中加入 DEPC 至终浓度 0.1%
2. 室温搅拌过夜（至少 4 小时）
3. 高压灭菌 15-20 分钟分解残留 DEPC
4. 注意：含 Tris 的溶液不能用 DEPC 处理，直接购买 RNase-free Tris

排查路径三：环境清洁

检查

• RNA 操作是否在专用超净台或 PCR 柜中
• 台面是否定期用 RNase 去除剂清洁
• 是否与 DNA 操作区混用

处理

• 划分专用 RNA 操作区，与 DNA 操作区物理隔离
• 台面和仪器用 RNase 去除剂（如 RNaseZap）擦拭
• 移液器用 70% 乙醇擦拭后用 RNase-free 水冲洗
• 每次操作前用 RNaseZap 擦拭台面、试管架、移液器

排查路径四：样本处理

检查

• 组织样本是否离体后立即冻存或裂解
• 裂解液是否足量（RNase 抑制剂需要足够浓度）
• 是否使用了 RNase 抑制剂（如 RNasin）
• 样本解冻是否在冰上操作

处理

• 组织样本离体后 30 分钟内液氮速冻，-80°C 保存
• 或直接加入 RNA 保存液（如 RNAlater）4°C 过夜后 -80°C 保存
• 裂解时确保裂解液体积是样本体积的 10 倍以上
• 裂解液配方含强变性剂（如异硫氰酸胍、β-巯基乙醇）
• 加入 RNase 抑制剂保护 RNA
• 样本解冻在冰上进行，避免室温反复冻融

验证 RNase 污染

方法一：对照实验

用已知完好的 RNA 样本（商业来源或之前提取的合格样本），在你怀疑有污染的环境中放置 30 分钟，然后跑胶。如果 RNA 降解，说明环境有 RNase。

方法二：试剂盒检测

使用 RNaseAlert 试剂盒，30 分钟内检测溶液或台面是否有 RNase 活性，结果直观。

方法三：RIN 值监测

用 Bioanalyzer 或 Fragment Analyzer 检测 RNA 完整性，RIN > 7 为合格。

常见误区

预防措施清单

• 专用 RNA 操作区，与 DNA 区隔离
• 全程戴口罩和双层手套
• 只用 RNase-free 耗材和 DEPC 处理水
• 台面每次用 RNaseZap 擦拭
• 组织样本离体后立即冻存或裂解
• 裂解液含强变性剂和 RNase 抑制剂
• 提取的 RNA 分装后 -80°C 保存
• 避免反复冻融，解冻在冰上操作
• 定期用对照实验验证环境无 RNase