模板质量怎么判断：做 PCR / qPCR 前先检查这些

先分清量、纯度、完整性和可扩增性

模板浓度正常，不等于 PCR 一定能扩增。紫外吸收读数、针对核酸的荧光定量、电泳和扩增对照分别回答不同问题；应把它们和样本来源、提取批次、保存记录一起看。特别是 RNA 和逆转录后的 cDNA，不应共用一个未经区分的“浓度合格”结论。

观察 → 检查 → 下一步

QIAGEN 的核酸定量说明区分了核酸数量与纯度的测量；MIQE précis则要求关注完整性、残留 DNA 与抑制物。不能用一个吸收比值代替下游验证。

第一步：核对每反应输入，不只看原液浓度

例如 DNA 原液 50 ng/µL，稀释 10 倍后每反应加入 2 µL，输入量为 10 ng。若漏记稀释倍数，就可能把实际输入高估十倍。计算见稀释工具。

对 RT-qPCR，还需记录逆转录前的 RNA 输入量、反应总体积及 cDNA 稀释倍数；这些数据支持样本间比较，但本身不保证逆转录效率相同。不同方法获得的浓度值不能未经验证就直接替换。

第二步：把对照放在正确环节

• 阳性模板：帮助确认引物、试剂、程序和检测能否工作；不能证明每个样本都没有抑制。
• NTC：检查反应试剂和操作中的污染或非特异信号；不是样本提取空白。
• 提取空白：跟随样本完成提取，帮助追踪提取链路污染。
• no-RT：用于 RT-qPCR 检查不经逆转录仍产生的信号。
• 外源加标：加在提取前可评估更完整的处理链路；加在提取后主要帮助评估扩增阶段影响。记录加标位置，否则结论容易混淆。

第三步：用小范围比较检查抑制

在同一检测体系中比较少量输入水平，保留不稀释或原条件作对照。稀释后表现改善可能提示抑制，但不能仅凭一次变化就认定是哪种残留物；低丰度目标可能因稀释而丢失信号。先确认操作和检测范围，再决定额外纯化或重提。

若所有样本连同阳性对照都失败，优先检查公共体系，而不是给每个样本追加纯化步骤。若只有某批样本异常，再检查该批的裂解、洗涤、洗脱和保存记录。

何时可以继续下游实验

应有可追溯的输入量、适合用途的完整性及可信的对照表现。常规短片段 PCR、长片段扩增和建库对模板的要求不同，不设一个覆盖所有用途的统一合格线。问题仍未定位时，保留原样本与记录，再做小规模验证，避免反复处理耗尽样本。

参考与下一步

• MIQE précis：qPCR 前的模板质量检查。
• QIAGEN DNA 定量说明：方法选择与读数边界。
• 扩增偏晚见Ct 值偏高排查；输入和对照正常但效率异常时见扩增效率排查。