为什么 RNA 完整性很重要
RNA 完整性直接影响 RT-qPCR、RNA-seq、Northern blot 等下游实验的可靠性。轻度降解会导致基因表达定量不准确，严重降解则直接导致实验失败。
完整性与下游实验的匹配表：
| 完整性等级 | 凝胶表现 | RIN 范围 | 可用的下游实验 | 不能做的实验 |
|---|---|---|---|---|
| 优秀 | 28S:18S ≈ 2:1，边缘锐利，几乎无拖尾 | 8.0-10.0 | RNA-seq、RIP-seq、CLIP-seq、mRNA-seq、长片段 RT-PCR（>2 kb） | — |
| 良好 | 28S 仍比 18S 亮，但 28S 边缘略模糊 | 7.0-8.0 | RT-qPCR（短/中片段）、Northern blot、常规 RT-PCR（<1.5 kb）、表达谱芯片 | 高灵敏度 RNA-seq、长读长测序 |
| 轻度降解 | 28S 明显变弱，5S 下方开始有低分子量拖尾 | 5.0-7.0 | RT-qPCR（扩增子 <500 bp）、miRNA 检测、cDNA 文库构建（锚定引物） | 长片段扩增、全转录组测序 |
| 中度降解 | 28S 几乎看不到，只剩 18S，整体呈拖尾 | 3.0-5.0 | 部分 qPCR（高表达基因、<300 bp 扩增子） | RNA-seq、Northern blot、大多数长片段实验 |
| 严重降解 | 全泳道呈 Smear 状，无清晰条带 | <3.0 | 无可靠下游用途，建议返工重提 | — |
凝胶电泳判断方法
正常 RNA 电泳图
真核生物完整 RNA 应呈现 28S、18S、5S 三条清晰条带，28S 条带亮度约为 18S 的两倍。
常规琼脂糖电泳注意事项：
- 胶浓度：1.2-1.5% 琼脂糖（变性胶效果更好，可用甲醛变性胶或 MOPS 系统）
- 电压：5-8 V/cm，低电压跑，避免高热导致 RNA 降解
- 上样量：0.5-2 μg 总 RNA / 泳道（太少看不到，太多带形拖）
- 变性加载液：含甲酰胺 + 甲醛的 RNA loading buffer（不要用普通 DNA loading buffer）
- 对照：每次跑同一批已知完整的 RNA 作为阳性对照（如冻存管里的标准品）
降解的典型表现
降解 RNA 的凝胶图呈现弥散状，28S 和 18S 条带模糊或消失，出现拖尾。严重降解时呈 Smear 状，几乎看不到清晰条带。
5 分钟快速评分（肉眼版）：
| 观察点 | 得分（满分 10） |
|---|---|
| 28S 条带是否明显比 18S 亮（≥1.5×）？ | +3 分 |
| 28S 条带边缘是否锐利清晰（无明显上沿拖尾）？ | +2 分 |
| 18S 和 5S 之间是否干净（无中间 Smear）？ | +2 分 |
| 5S 下方是否无明显低分子量杂带？ | +1 分 |
| 孔口是否无亮带（无基因组 DNA 残留）？ | +1 分 |
| 各泳道是否无向上方的拖尾（说明 RNA 没在孔里降解）？ | +1 分 |
评分 ≥ 8 → 优秀；6-7 → 良好；4-5 → 轻度降解；≤3 → 不能用。
判断标准
轻微降解时 28S 和 18S 仍可见但边缘模糊，适合做 RT-PCR 但不适合做 RNA-seq。中度降解时仅有 18S 可见，5S 区弥散，仅能做较短片段的 RT-PCR。严重降解时无法用于大多数下游实验。
Bioanalyzer 与 RIN 值
Agilent Bioanalyzer 能给出 RIN 值（RNA Integrity Number），这是评估 RNA 完整性的金标准。RIN 10 表示最完整，RIN 1 表示完全降解。
RIN 值参考标准
RIN 大于 8.0 表示 RNA 完整性优秀，适合所有下游应用包括 RNA-seq。RIN 7.0-8.0 表示轻度降解，适合大多数基因表达分析。RIN 5.0-7.0 表示中度降解，仅适合较短片段扩增。RIN 小于 5.0 表示严重降解，下游应用受限。
除了 RIN 值，还要看 Bioanalyzer 的其他指标：
- RNA 浓度：如果仪器报的浓度和 Nanodrop 差 2 倍以上 → Nanodrop 测的是降解小片段，真实完整 RNA 浓度低
- 峰图形状：28S 和 18S 是两个尖锐的峰，还是扁平的丘 → 扁平 = 降解
- Fast Region：<200 nt 区域是否有巨大凸起 → miRNA/降解小片段堆积
- Genomic DNA 峰：在 28S 上方是否出现又宽又高的峰 → 有 gDNA 残留，需要 DNase 处理
RNA 6000 Nano vs Pico 芯片选择：
- 常规样本（1-100 ng/μL）：用 Nano 芯片，RIN 值更稳定
- 珍贵样本（<1 ng/μL）：用 Pico 芯片，但 RIN 的 CV 略大
- 细胞外泌体 / FFPE 降解严重样本：不用 RIN，改用 DV200（>200 nt 片段占比）
其他快速评估方法
| 方法 | 所需设备 | 检测下限 | 说明 |
|---|---|---|---|
| RT-qPCR 检测两个内参（短 + 长扩增子） | qPCR 仪 | 10 pg RNA | 短扩增子（<200 bp）和长扩增子（>1500 bp）Ct 差异 ≤ 4 为 OK；>7 说明降解严重 |
| TapeStation 4200（RINe/RQN） | TapeStation | 1 ng | 类似 Bioanalyzer，成本更低，通量更高 |
| Qubit BR RNA + Nanodrop 结合 | 两仪 | 20 ng | Qubit 测”真实 RNA”，Nanodrop 测”所有核酸”，两者比值 >0.8 → 完整性 OK；<0.5 → 降解严重 |
| qPCR 预扩增引物 3’/5’ 比值 | qPCR 仪 | 100 ng | 用 GAPDH 3’端引物和 5’端引物，Ct 比值 ≤ 2 为完整；>3 说明 mRNA 有降解 |
注意事项
凝胶电泳判断主观性较强，不同操作者可能给出不同结论。有条件时优先使用 Bioanalyzer 或 TapeStation 等仪器检测。样品应始终保存于 -80°C 并避免反复冻融。
避免 RNA 在”提取后 → 检测前”期间二次降解：
- RNA 提取后不要放 4°C 超过 24 h，-80°C 分装冻存
- 冻融不超过 2 次（RT-qPCR 也会受影响）
- 取 RNA 时全程冰上操作，管口离开超净台要盖好
- 不要用 DEPC 水处理的枪头反复抽提 RNA（DEPC 会抑制部分下游酶）
延伸阅读：RNA 降解排查与补救、RNA 提取操作指南、RNase 污染防范。