Western blot 实验避坑清单：开始前必须注意的 11 件事

做之前先确认这些

• 裂解液体系是否会影响蛋白定量（含还原剂、螯合剂时避开 BCA，改用 Bradford 或先稀释）
• 上样量是否落在 20–40 μg 总蛋白区间，不要超载
• 目标蛋白大小已知，胶浓度已匹配（小蛋白用高浓度胶，大蛋白用低浓度胶）
• 转膜方式按蛋白大小选好：小蛋白湿转，大蛋白注意 PVDF 孔径
• 一抗稀释比是否做过梯度优化，而不是直接用说明书推荐的最大浓度
• loading control 的分子量是否和目标蛋白拉开了 10 kDa 以上差距

最常见的坑

1. 蛋白定量不准：含还原剂（DTT、β-Me）或螯合剂（EDTA）的裂解液直接做 BCA，结果严重偏低
2. 上样量超载：总蛋白超过 50 μg / 孔，条带拖尾、压扁，定量也不准
3. 煮样时间过长：常规蛋白 95°C 5 min 足够；膜蛋白用 70°C 10 min，过度煮样会聚集
4. 胶浓度选错：跑 80 kDa 蛋白却用 15% 胶，分离度不够；跑 15 kDa 蛋白用 8% 胶跑不出
5. 转膜条件不匹配：小蛋白用半干转容易穿透，大蛋白转不下来
6. 封闭液选错：磷酸化抗体用脱脂奶粉封闭，milk 里的酪蛋白会交叉反应，背景爆表
7. 一抗稀释比直接照说明书：说明书给的 1:1000 是参考，不同样本和抗体效价差异大，不优化上来就高背景
8. 洗膜过度或不足：3×5 min 到 3×10 min 是稳妥范围，洗太少背景高，洗太多信号弱
9. 曝光只试一个时间：单一曝光要么过曝要么看不到弱带，必须做梯度曝光
10. loading control 与目标蛋白分子量接近：内参和目的条带挤在一起，无法分别定量
11. 二抗交叉反应：同时用两个种属来源的一抗，二抗会交叉识别，只用抗一种属的二抗

每一步的关键细节

• 蛋白定量：BCA 受还原剂干扰，先稀释样本 10 倍以上或换 Bradford，注意 buffer 兼容性
• 上样量：用 样品上样量计算 工具按浓度反推体积，目标 20–40 μg 总蛋白
• 煮样：常规 95°C 5 min；膜蛋白 70°C 10 min；样品别反复加热
• 胶浓度选择：<15 kDa 用 15%；15–40 kDa 用 12%；40–100 kDa 用 10%；>100 kDa 用 8%
• 转膜：小蛋白（<30 kDa）建议 100 V 湿转 90 min 加 0.2 μm PVDF；大蛋白（>100 kDa）延长到 2 h
• 封闭：磷酸化抗体和某些糖基化抗体用 5% BSA，常规抗体用 5% 脱脂奶粉，参考 western-milk-or-bsa-blocking
• 一抗稀释：从说明书推荐浓度的 1:500、1:1000、1:2000 三档梯度先试，背景高就往稀的方向走
• 洗膜：TBST 3×10 min，摇床 70 rpm；高背景时再增加 1 次洗涤
• 曝光：先试 30 s、1 min、5 min 三档，根据信号强弱再细化

出了问题怎么办

跑完发现条带异常，按以下顺序排查：背景高看封闭和洗膜（western-background-high）；没信号看样品和抗体（western-no-protein）；过曝看 western-blot-overexposure-fix-and-prevention；转膜和封闭细节见 western-transfer-and-blocking；抗体稀释优化见 western-antibody-dilution；抗体选择见 western-antibody-selection；样品制备细节见 western-sample-prep。

相关工具

• 样品上样量计算

相关阅读

• Western blot 样品制备时最容易忽略的细节
• Western blot 转膜与封闭条件怎么优化
• Western blot 抗体稀释倍数怎么定
• Western blot 封闭用脱脂奶粉还是 BSA？选择依据与互换风险