siRNA 转染实验指南：设计、终浓度计算与敲低验证

先明确：要验证敲低，还是解释功能表型？

siRNA 可以用于短期降低目标 RNA 水平，但转染进入细胞、目标 mRNA 降低、目标蛋白降低和出现功能表型，是不同的验证环节。应先确定目标转录本、检测读数与对照，再选择递送方法和条件，避免把荧光进入细胞直接当作功能敲低成功。

本文给出科研用 siRNA 实验的设计与记录框架。合成短双链 siRNA 可参与 RNAi 效应过程；不要把长双链 RNA 或 shRNA 的加工步骤直接套成所有合成 siRNA 的必经步骤。具体试剂的操作参数应核对所用品类和版本的官方流程。

步骤 1：确认目标和 siRNA 产品

记录物种、基因、转录本编号、需要覆盖的剪接亚型，以及用于检测的引物或抗体。确认 siRNA 与样本实际表达的转录本匹配；基因名称相同，不保证所有亚型都被覆盖。

要核对的内容	为什么需要核对
靶序列与转录本覆盖	区分检测总表达还是某个亚型，避免靶标与检测对象错位
是否有独立靶序列	单条序列的表型不足以排除脱靶；保留独立验证路径
非靶向对照的设计和化学类型	尽量与实验 siRNA 的处理保持可比，不能只凭“乱序”名称推断无影响
厂家验证的范围	预设计或预验证结果不保证在所有细胞和条件中都有效
修饰、溶解与保存要求	影响处理和递送选择，按产品说明记录

自设计时，可参考 Thermo Fisher 的 siRNA 设计说明核对序列与特异性要求。GC 含量只是设计因素之一，不用一个固定范围承诺敲低效果，也不把偏高简单解释为无法进入 RNAi 通路。

**产品类别要分清：**ON-TARGETplus 是 siRNA 产品系列；DharmaFECT 是递送试剂，不能把前者当作一种 LNP 转染试剂。Dharmacon 官方分类可用于核对。CRISPick 的定位是 CRISPR 试剂设计，故不列作本教程的 siRNA 设计工具，见 Broad 官方平台介绍。

步骤 2：把必要对照写进实验计划

条件	主要用途	不能单独排除什么
未处理细胞	提供细胞与读数基线	不能单独区分递送试剂与 siRNA 的影响
仅递送试剂（mock）	观察递送过程或试剂相关影响	不能代替非靶向 siRNA 对照
非靶向 siRNA，加相同递送条件	检查寡核苷酸与递送的非目标影响	不能证明目标 siRNA 没有序列相关脱靶
已知在该体系中有效的阳性 siRNA	帮助判断递送和检测是否工作	阳性有效不保证另一靶标一定能同样敲低
独立靶序列	检查目标敲低与表型是否一致	一致性仍需结合毒性、检测与实验设计解释

关键功能结论可进一步安排适当的救援实验等验证，但救援构建本身也需要验证。不能将单一阴性对照或某个“敲低百分比”视为所有结论的充分证据。

步骤 3：先算母液与每孔终浓度

溶解液、母液浓度、分装和储存按产品说明执行，记录实际批次及冻融情况。不要使用没有依据的“冻融几次必然损失多少效率”来判定试剂失效。

配液可用：

V母液 = C终浓度 × V最终体系 ÷ C母液

下面只演示单位换算，不是推荐起始剂量。假设 siRNA 母液为 20 µM，计划最终每孔 2.0 mL、终浓度 10 nM：

20 µM = 20,000 nM = 20 pmol/µL。
每孔所需 siRNA 为 10 nM × 2.0 mL = 20 pmol。
母液体积为 20 pmol ÷ 20 pmol/µL = 1.0 µL。

最终体积应包括加入的复合物体积。若基础培养液已有 2.0 mL，之后又加入 0.5 mL，最终体系就是 2.5 mL，不能继续按 2.0 mL 计算。

每孔最终体积	假设终浓度	siRNA 总量	20 µM 母液体积
0.5 mL	10 nM	5 pmol	0.25 µL
2.0 mL	10 nM	20 pmol	1.0 µL

0.25 µL 可能超出所用移液器的可靠范围，应采用适合该产品的中间稀释或多孔配液方案，并把中间液也计入最终体积。可用稀释计算器复核。

步骤 4：按细胞和具体产品选择递送路线

脂质递送、电转等方法的适用性取决于细胞、siRNA 产品与检测目的。不能仅按贴壁或悬浮两类就承诺某种方法最优，也不能把某个 siRNA 品牌直接当作递送技术。

选择流程时至少记录：细胞来源与代次范围、状态与接种量、容器规格、递送试剂及批次、复合物配制条件、培养条件和检测时间。接种数、培养基、是否换液及试剂用量应按具体流程确定，再通过小规模比较验证。

例如 RNAiMAX 官方协议提供了不同规格的条件与优化范围。不要把来自另一份流程的试剂量、复合物体积和孵育时间拼成一个混合配方。换孔板也不能只按培养基体积等比例放大：培养面积、细胞数和试剂比例都要复核。

步骤 5：用小规模预实验比较有效性与毒性

先选择产品说明允许的少量条件，配套非靶向、mock 和阳性对照。一次改变关键变量时，保留原条件，记录每孔实际输入与完整体积，而不只记录“加了几微升”。

预实验同时看三件事：

细胞状态和适合该体系的活性指标，判断处理影响。
目标 mRNA 是否相对可比的非靶向对照下降。
需要蛋白或功能结论时，相应读数是否支持。

选择能支持目的且处理影响可接受的条件，不把最高 siRNA 用量或最低 mRNA 读数自动选作最佳条件。

步骤 6：区分 mRNA、蛋白与功能验证

读数	要确认的条件	解释边界
RT-qPCR	模板、对照、特异性、效率及参考基因稳定性	mRNA 降低不保证蛋白已同步下降
Western blot 或其他蛋白检测	抗体适用性、阳性样本、线性检测与归一化	条带变化还可能受细胞数量或处理影响
功能实验	对照、检测时间、细胞状态与独立重复	表型差异不自动证明由目标特异敲低造成

不同目标的 RNA 与蛋白周转不同，检测时间应由预实验和已验证流程确定，不固定为所有细胞的同一个时间窗口。RT-qPCR 说明见相对定量和参考基因选择；蛋白检测准备见WB 样品制备。

表达量算例

假设在同一次有效的相对定量分析中，非靶向对照的归一化表达量为 1.00，靶向处理组为 0.40，则相对于该对照的 mRNA 降低为：

(1 − 0.40 ÷ 1.00) × 100% = 60%

这是计算演示，不能凭它宣称实验已达标或表型由目标特异敲低导致。还需看独立重复、变异程度、细胞状态及目的要求；也不能拿不同批次未经可比处理的数据直接代入。

常见问题：按对照结果选下一步

观察	先检查	下一步
阳性和目标 siRNA 都没有预期读数	细胞状态、递送、试剂处理和检测链路	先验证公共环节，不立即重设计所有靶点
阳性有效，目标 siRNA 无效	目标表达、转录本覆盖、检测位置与时间	比较独立靶序列和适当时间点，不保证加量能解决
mRNA 降低，蛋白未明显变化	蛋白检测质量、目标周转和取样时间	验证检测与时间关系，避免直接增加 siRNA
非靶向与靶向处理都出现毒性	递送、总输入和培养条件	优先降低处理干扰，再解释功能表型
一条 siRNA 有表型，另一条没有	各自敲低程度、毒性和检测一致性	不能立即认定脱靶或特异，补充独立验证
处理后效应随时间减弱	细胞增殖、目标恢复和测量可比性	先做时间记录，不默认每隔几天重复转染