概述
siRNA（Small Interfering RNA）介导的 RNAi（RNA Interference）是目前最常用的基因沉默技术之一。通过向细胞内引入 21 bp 左右的双链 RNA，利用细胞自身的 RNAi 通路降解同源 mRNA，从而实现目标基因表达量的下调（knockdown）。
相比于 CRISPR-Cas9（基因敲除，knockout），siRNA 有以下优势：
- 操作简单：无需构建载体，转染即可生效
- 周期短：48-72 小时即可看到效果
- 可逆：瞬时转染，7-10 天后效果消失，适合短期功能研究
- 多基因并行：可同时转染多个 siRNA 靶向不同基因
但 siRNA 转染也常遇到效率低、沉默不稳定、脱靶效应三大问题。本文从 siRNA 设计到效果验证，提供完整的操作流程（SOP）。
siRNA 基本原理
siRNA 双链进入细胞
↓
Dicer 酶切成长度 21 nt 的小干扰 RNA
↓
siRNA 与 Argonaute 蛋白结合形成 RISC 复合物
↓
siRNA 的反义链引导 RISC 识别互补的 mRNA
↓
Argonaute 切割 mRNA 或抑制翻译
↓
目标蛋白表达量下降（通常下调 50-90%）关键参数：
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| siRNA 长度 | 21-22 nt | 标准长度，太短脱靶风险高 |
| GC 含量 | 45-55% | 过高达不到细胞内 RNAi 通路，过低特异性差 |
| 3’ 端 overhang | dTdT | 标准设计，提高细胞内稳定性 |
| 2’-O-methyl 修饰 | 有（可选） | 提高 siRNA 稳定性，减少脱靶 |
完整 SOP 流程
Step 1：siRNA 设计与订购
好的 siRNA 是成功的第一步。
推荐策略
| 策略 | 操作 | 优缺点 |
|---|---|---|
| 直接订购验证过的 siRNA | 购买 Dharmacon / Qiagen / Sigma 的预验证 siRNA | ✅ 最可靠，厂家已验证有效；❌ 较贵 |
| 订购 Pooled siRNA | 同一基因设计 4 条独立 siRNA 混合使用 | ✅ 沉默效果更强；❌ 可能增加脱靶 |
| 设计单条 siRNA | 用在线工具设计后合成 | ✅ 便宜；❌ 需要自己验证效果 |
推荐： 如果预算允许，直接订购 Dharmacon 的 ON-TARGETplus 系列，是目前业内评价最高的预验证 siRNA。
设计原则（如果自己设计）
| 原则 | 说明 | 示例 |
|---|---|---|
| 靶向外显子区 | 避开内含子和 3’UTR 的非编码区 | 优先 targeting CDS |
| 避开 SNP | 检查靶点区域是否有常见 SNP | NCBI dbSNP 查询 |
| GC 含量 45-55% | 最佳条件 | %GC 计算 |
| 连续相同碱基 ≤ 4 | 避免连续 AAAAA 或 GGGG | 减少非特异性结合 |
| BLAST 特异性检查 | 避免与其他基因同源 | NCBI BLAST |
推荐在线设计工具
| 工具 | 开发者 | 特点 |
|---|---|---|
| Dharmacon siDESIGN Center | Dharmacon | 业内权威，支持 off-target 预测 |
| RNAi Designer | Invitrogen | Torpedo 算法，考虑多项参数 |
| siRNA Target Finder | Ambion | 经典工具，易于使用 |
| CRISPick | Broad Institute | 含 siRNA 设计，脱靶预测好 |
订购建议
- 至少订购 2-3 条独立 siRNA 靶向同一基因，避免单条 siRNA 效果不好需要重新订购
- 注意区分 scramble control（乱序对照）和 siCtrl（阴性对照）的区别
- 对于关键实验，建议先做小量预实验，确认有效后再大量订购
Step 2：siRNA 母液制备
收到的 siRNA 通常是冻干粉，需要稀释成母液。
操作步骤
1. 短暂离心（10,000 rpm, 30 秒）将冻干 siRNA 聚集到管底
2. 用无 RNase 的蒸馏水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 溶解
3. 推荐终浓度：20 μM（工作浓度的 100-400 倍）
4. 轻柔混匀，短暂离心
5. 分装成 5-10 μL 小份，-20°C 储存
6. 避免反复冻融（反复冻融 3 次以上效率下降 30-50%）| 管内总 siRNA 量 | 加入溶剂量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 50 nmol | 2,500 μL | 20 μM |
| 10 nmol | 500 μL | 20 μM |
| 5 nmol | 250 μL | 20 μM |
⚠️ 注意：整个操作在 RNase-free 环境下进行，戴手套、用无 RNase 枪头！
Step 3：转染试剂选择
siRNA 对转染试剂的要求比质粒高，因为：
- siRNA 是小分子（~14 kDa），更容易被脂质体包裹效率低
- 细胞内 siRNA 浓度需要达到 pmol 级才能激活 RNAi 通路
推荐试剂对比
| 试剂 | 厂家 | 适用细胞 | 用量参考（6-well） | 特点 |
|---|---|---|---|---|
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 广谱贴壁细胞 | 3 μL + 50 pmol siRNA | 金标准，siRNA 专用，效率稳定 |
| On-Target plus (LNP) | Dharmacon | 广谱，尤其悬浮/原代 | 按产品说明 | 脂质纳米粒，对难转染细胞好 |
| DharmaFECT 1/2/3/4 | Dharmacon | 按细胞类型匹配 | 3-5 μL + 50 pmol siRNA | 4 种配方可选，广谱 |
| TransIT-siQUEST | Mirus | 贴壁细胞 | 5 μL + 50 pmol siRNA | 无血清兼容 |
| Amaxa Nucleofection | Lonza | 原代/悬浮/干细胞 | 电穿孔参数见手册 | 非试剂法，适合难转染细胞 |
首选推荐：Lipofectamine RNAiMAX（贴壁细胞）或 On-Target plus LNP（悬浮/原代细胞）
Step 4：细胞准备
siRNA 转染对细胞状态要求很高，以下参数不能妥协：
关键参数
| 参数 | 推荐值 | 原因 |
|---|---|---|
| 细胞代龄 | 10-30 代 | 细胞老化后对转染试剂敏感性下降 |
| 细胞汇合度 | 40-60%（转染当天） | 贴壁细胞需要足够生长空间 |
| 细胞活力 | >90% | 死细胞不被转染，影响整体效率 |
| 培养基 | 完全培养基（含血清） | RNAiMAX 等试剂可含血清转染 |
| 抗生素 | 转染当天去掉 | 青霉素/链霉素在转染时会增加细胞死亡 |
铺板参考（以 6-well 板为例）
| 细胞系类型 | 每孔接种细胞数 | 转染时汇合度 |
|---|---|---|
| HEK293T（快速生长） | 150,000 | ~50%（24h 后） |
| HeLa（中等生长） | 120,000 | ~50%（24h 后） |
| HepG2（缓慢生长） | 200,000 | ~50%（24h 后） |
| 悬浮细胞（Jurkat） | 300,000 | 直接转染（悬浮） |
铺板时间：转染前 18-24 小时铺板
Step 5：正式转染操作（以 Lipofectamine RNAiMAX 为例）
这是目前最常用的 siRNA 转染操作流程。
6-well 板操作
试剂准备：
- Lipofectamine RNAiMAX（使用前充分混匀）
- siRNA 母液（20 μM）
- Opti-MEM 或无血清培养基
操作步骤：
1. 转染前 4-6 小时，将细胞培养基换成含 2% FBS 的完全培养基（可选，有助于转染）
2. 制备复合物（每孔）：
管 A（siRNA 稀释）：
- 2.5 μL siRNA 母液（20 μM → 50 pmol）
- 250 μL Opti-MEM
管 B（试剂稀释）：
- 3 μL Lipofectamine RNAiMAX
- 250 μL Opti-MEM
3. 室温孵育 5 分钟
4. 将管 A 加入管 B，轻轻混匀（不要振荡！）
5. 室温孵育 15-20 分钟（形成复合物）
6. 加入细胞：
- 吸去原有培养基
- 加入 1.5 mL 完全培养基
- 再逐滴加入 500 μL 复合物
- 轻轻晃匀
7. 培养箱孵育：
- 37°C, 5% CO₂
- 可 24 小时不换液（RNAiMAX 毒性低）
- 或 4-6 小时后换液（如果细胞毒性明显）
8. 48-72 小时后收样检测沉默效果其他孔板体积换算
| 孔板类型 | 培养基体积 | siRNA 用量 | RNAiMAX 用量 | 复合物体积 |
|---|---|---|---|---|
| 384-well | 50 μL | 1 pmol | 0.06 μL | 10 μL |
| 96-well | 100 μL | 5 pmol | 0.3 μL | 20 μL |
| 48-well | 250 μL | 12.5 pmol | 0.75 μL | 50 μL |
| 24-well | 500 μL | 25 pmol | 1.5 μL | 100 μL |
| 12-well | 1 mL | 37.5 pmol | 2.25 μL | 150 μL |
| 6-well | 2 mL | 50 pmol | 3 μL | 500 μL |
| T-25 flask | 5 mL | 250 pmol | 15 μL | 2,500 μL |
| T-75 flask | 12 mL | 750 pmol | 45 μL | 7,500 μL |
Step 6：效果验证
转染后 48-72 小时（siRNA 作用高峰），验证沉默效果。
验证方法对比
| 方法 | 检测对象 | 优点 | 缺点 | 时间点 |
|---|---|---|---|---|
| qPCR | mRNA 水平 | 快速、灵敏、通量高 | 需要设计引物、有假阳性 | 转染后 48-72h |
| Western Blot | 蛋白水平 | 直接检测目标蛋白变化 | 需要抗体，操作复杂 | 转染后 72-96h（蛋白半衰期） |
| 免疫荧光 | 细胞内定位 + 表达量 | 直观 | 需要荧光抗体 | 转染后 72h |
| 功能实验 | 表型变化 | 直接回答”敲低后表型是否变化” | 时间长、变量多 | 转染后 3-7 天 |
推荐验证策略
第一步：qPCR（初筛）
1. 收细胞，用 TRIzol 或试剂盒提 RNA
2. 反转录成 cDNA（见 [RNA 提取指南](/articles/rna-extraction-guide/)）
3. 设计目标基因 + 内参基因引物（内参选 GAPDH / ACTB / HPRT1）
4. qPCR 检测（见 [qPCR 相对定量](/articles/qpcr-relative-quantification/)）
5. 判断标准：
- >50% 下调 → 有效
- 30-50% 下调 → 一般，可优化 siRNA 用量
- <30% 下调 → 效果差，考虑换 siRNA 或试剂第二步：Western Blot（确认）
qPCR 有效后，用 WB 确认蛋白水平确实下降。这是最终金标准。
对照组设置
siRNA 实验必须设置充足的对照组，否则结果不可靠：
| 对照组 | 作用 | 是否必须 |
|---|---|---|
| scramble siRNA 对照 | 排除非特异性 RNAi 引起的脱靶效应 | ✅ 必须 |
| Untreated 对照 | 排除转染试剂本身的影响 | ✅ 必须 |
| 空白对照（只加试剂） | 看试剂本身毒性 | ✅ 推荐 |
| 阳性对照（已知有效 siRNA） | 验证转染体系正常工作 | ⭐ 强烈推荐 |
| 不同浓度梯度 | 找到最佳 siRNA 用量 | 推荐 |
Step 7：优化与问题排查
沉默效果差的排查清单
先查"体系是否正常"：
├─> 阳性对照 siRNA 是否有效？
│ ├─> 有效 → 体系没问题，问题在目标 siRNA
│ └─> 无效 → 转染体系本身有问题
│
├─> 转染体系问题排查：
│ ├─> 细胞状态不好？（代龄太高 / 污染 / 消化损伤）
│ ├─> 细胞汇合度不对？（转染时太密或太稀）
│ ├─> siRNA 母液降解？（重新新溶一管试试）
│ ├─> 试剂过期？（换新试剂试试）
│ └─> 操作问题？（复合物孵育时间 / 温度 / 混匀方式）
│
└─> 目标 siRNA 问题：
├─> 设计不好？（换另一条独立 siRNA）
├─> 靶点区域不对？（换不同外显子的 siRNA）
├─> 基因本身表达太低？（可能不需要 siRNA）
└─> 存在可变剪接？（siRNA 可能只打到了部分亚型）脱靶效应排查
脱靶（Off-Target Effect, OTE）是 siRNA 实验最常见的陷阱。
脱靶的常见症状：
- 沉默效果很好，但表型与文献报道相反
- 表型很明显，但另外两条独立 siRNA 没有同样效果
- 基因表达谱出现大量非预期变化
解决方案：
| 方法 | 说明 | 难度 |
|---|---|---|
| 用 2’-O-methyl 修饰 siRNA | 厂家合成时加入修饰，减少脱靶 | 低（直接订购修饰 siRNA） |
| 转染低浓度 siRNA | 5-25 pmol 比 50 pmol 脱靶少 | 低 |
| 用两条独立 siRNA 交叉验证 | 表型一致才可信 | 中 |
| Rescue 实验 | 过表达抗 siRNA 的靶基因，表型应恢复 | 高（需要构建过表达载体） |
常见问题与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 转染后细胞大量死亡 | siRNA 浓度过高 / 试剂毒性大 | 降低 siRNA 和试剂用量，换低毒试剂 |
| qPCR 显示 mRNA 没变化 | siRNA 设计不好 / 靶点不对 | 换另一条 siRNA，检查靶点是否在外显子 |
| WB 显示蛋白没变化 | mRNA 下调但蛋白稳定 / siRNA 浓度不够 | 增加 siRNA 用量，检查蛋白半衰期 |
| 沉默效果 3 天后消失 | siRNA 降解 | 做加强转染（第 3 天再转一次），或换更稳定的修饰 siRNA |
| 不同批次实验结果差异大 | 细胞代龄 / 试剂批次 / 操作不一致 | 固定细胞代龄、试剂批次，每次做阳性对照 |
| 悬浮细胞转染几乎无效 | 脂质体对悬浮细胞效率低 | 换 LNP（On-Target plus）或电穿孔（Amaxa） |
siRNA vs 其他基因调控方法
| 方法 | 速度 | 效果类型 | 可逆性 | 特异性 | 操作难度 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| siRNA | 快（48-72h） | 瞬时 knock-down | 可逆 | 中（脱靶风险） | 低 | 短期基因功能研究 |
| shRNA（稳定株） | 慢（2-4 周） | 持续 knock-down | 不可逆 | 中 | 中 | 需要长期沉默的实验 |
| CRISPR-Cas9 | 中（1-2 周） | 永久 knock-out | 不可逆 | 高 | 高 | 永久基因敲除验证 |
| ASO（反义寡核苷酸） | 中（48-96h） | 瞬时 knock-down | 可逆 | 较高 | 低 | 特殊位点（如 UTR）沉默 |
| CRISPRi | 中（1-2 周） | 持续 knock-down | 不可逆（需失活 Cas9） | 高 | 高 | 需要精确调控的体系 |
选择建议：
- 快速筛选基因功能 → siRNA
- 需要长期稳定沉默 → shRNA 慢病毒
- 需要永久敲除验证 → CRISPR-Cas9
总结
siRNA 转染成功的关键是五个匹配：
- siRNA 匹配靶点：用 2-3 条独立 siRNA，避开 SNP
- 试剂匹配细胞类型：贴壁细胞用 RNAiMAX，悬浮/原代用 LNP 或电穿孔
- 细胞状态匹配：代龄 <30 代，汇合度 40-60%，活力 >90%
- 用量匹配：从 50 pmol/well（6-well）起步，梯度测试确定最佳
- 验证匹配：qPCR 初筛 + WB 确认 + 脱靶检查
记住：siRNA 沉默有效 ≠ 表型变化有意义。永远要用独立 siRNA 重复实验、做 Rescue 实验来确认你的结果不是脱靶效应导致的。
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- 稀释计算器：计算 siRNA 母液稀释到工作浓度的体积
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本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。