为什么 Marker 不是随便买一根就行
Western Blot 的蛋白 Marker（Protein Ladder / Standard Marker）有 四个核心用途：
- 电泳监控：跑胶时能看到条带位置、判断跑没跑歪、是否跑够时间
- 转膜监控：让你知道膜上有没有转到蛋白、转膜是否均匀
- 分子量估算：目标条带在 Marker 中间的位置，用来估 kDa
- 定量参考：荧光或化学发光定量 Marker 可以作为内参用于灰度定量
但不同类型的 Marker 在这四个方面的表现差别很大。选错了会出现：
- 彩虹 Marker 在化学发光检测下什么都看不到
- 小蛋白 Marker 只能跑到 10 kDa，无法估 8 kDa 蛋白
- 预染 Marker 本身带的染料让某些条带被遮掉
下面系统对比四类主流 Marker。
四类 Marker 核心对比
预染 Marker（Prestained Marker）
- 定义：每个蛋白条带在合成时就共价结合了一种或多种染料（蓝色、红色或多种）
- 电泳时就可见：加样后跑胶过程中能看到条带往下跑
- 转膜后仍可见：膜上也能看到，用来验证转膜
- 颜色类型：单色（全蓝或全红）、多色（每个分子量不同颜色，称 “彩虹 Marker”）
未预染 Marker（Unstained / Standard Marker）
- 定义：无染料的纯净蛋白混合物
- 用途：跑胶后用 Coomassie 或银染显条带；或用 Ponceau S 染膜
- 分子量估算：需要跑完再染色，不能实时监控
荧光 Marker（Fluorescent / Fluorescently Labeled Marker）
- 定义：用荧光染料（如 Cy5、IRDye 800CW）标记的蛋白条带
- 检测：在荧光成像系统（Odyssey、Licor、Typhoon）中检测
- 优点：可同时作为分子量 marker 和内参（荧光强度已知，可用于定量归一化）
- 缺点：贵，必须配荧光成像系统
化学发光 Marker（Chemiluminescent / Western Blot Standard Marker）
- 定义：用 HRP 标记的蛋白条带
- 检测：化学发光显影后与目标蛋白条带一起出现在同一张图上
- 优点：在化学发光图里直接有分子量标尺，不会因为 Marker 染料颜色遮挡目标条带
- 缺点：只在化学发光后可见，电泳和转膜过程中看不到
快速对比表
| Marker 类型 | 电泳时可见 | 转膜后可见 | 化学发光图可见 | 荧光图可见 | 分子量估算精度 | 成本 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 预染（单色） | 是 | 是 | 否（但膜上还能看到） | 否 | 中 | 低 |
| 预染（彩虹/多色） | 是，不同颜色 | 是 | 否（膜上仍有颜色） | 否 | 中-高（颜色对应位置） | 中 |
| 未预染 | 否 | 需 Ponceau S 染 | 否 | 否 | 高（用考染显带） | 最低 |
| 荧光 | 否 | 否（需荧光扫描） | 否 | 是，带分子量 | 高 | 高 |
| 化学发光 | 否 | 否 | 是，带分子量 | 否 | 高 | 中 |
分场景选择建议
场景 1：常规 WB 化学发光检测（最常见）
推荐：预染彩虹 Marker 作为主 + 化学发光 Marker 作为补充
理由：
- 彩虹 Marker 让你电泳时能监控条带位置、转膜时能看见成功与否
- 化学发光 Marker 让你在最终曝光图上直接有分子量标尺，不再需要把膜图和彩虹叠加对齐
- 这是今天实验室最主流的组合
只用一种的话，优先顺序：彩虹 Marker > 单色预染 > 化学发光 Marker
场景 2：荧光检测（如 Licor Odyssey 双通道）
推荐：荧光 Marker（同通道或另一通道标记）
理由：
- 荧光系统中预染 Marker 的染料可能在相应通道有干扰
- 荧光 Marker 有明确的分子量标记条，直接在图上可见
- 同时还能做定量归一化
场景 3：小分子蛋白（< 10 kDa）
推荐：
- 先用低分子量 Marker（范围 2–200 kDa），确保覆盖你的目标蛋白
- 部分 Marker 跑到 < 10 kDa 后条带会拖尾，选有专门低分子量条带的产品
常见低分子量范围（供参考，实际以商品为准）：
| 产品 | 分子量范围 | 适合目标 |
|---|---|---|
| PageRuler Low Range | 3.4–100 kDa | 5 kDa 以下小肽 |
| Spectra Low Range | 3–225 kDa | 通用 |
| Novex Sharp Pre-stained | 3.5–260 kDa | 常用 |
| ProteinRuler Low Range | 2–250 kDa | 低分子量完整覆盖 |
场景 4：高分子量蛋白（> 150 kDa）
推荐：
- 高分子量 Marker（范围 25–300 kDa 或 15–500 kDa）
- 同时要用 4–8% 的低浓度胶（高分子量需要更疏松的孔径）
- 转膜时间要延长到 1.5–2 小时，或过夜 4°C
场景 5：转膜质量验证
推荐：彩虹 Marker 或单色预染 Marker（这是唯一能实时看转膜的）
理由：
- Marker 条带从胶上跑到膜上后，能直接在膜上看到
- 如果胶上 Marker 清晰但膜上 Marker 全糊了或没了，说明转膜参数（时间、电流、缓冲液）有问题
- 这是排查转膜问题最直接的工具（参考 转膜参数怎么选）
场景 6：考马斯亮蓝染色（直接染胶）
推荐：未预染 Marker
理由：
- 考染时预染 Marker 的染料会影响考染效果
- 未预染 Marker 的条带在考染后干净清晰
- 如果只做考染不转膜，没必要花钱买预染 Marker
Marker 在各步骤中的正确加样与解读
加样位置
- 独立泳道，不要混到样品里
- 胶的左右两侧各加一份（特别是多泳道、大胶），防止边缘效应导致条带倾斜时分子量估算偏差
- 小胶（10 泳道以内）加一侧即可
加样体积
- 按厂家说明书（通常 3–5 μL / 泳道）
- 加太少：条带太弱看不清；加太多：条带会加宽拖尾
- 不要和样品用同一排枪头，避免交叉污染
电泳中的 Marker 解读
| 现象 | 可能原因 | 下一步 |
|---|---|---|
| Marker 条带全部模糊拖尾 | 电压太高、电泳液老化 | 降电压、换 fresh running buffer |
| 两侧 Marker 倾斜 | 胶灌歪、加样孔不平 | 下次灌胶时对齐 |
| 高分子量条带压缩 | 胶浓度太低、电压太低 | 用稍高浓度胶或延长时间 |
| 低分子量条带挤出胶底 | 跑胶时间太长 | 用 marker 最低条带到边界时及时停 |
转膜后的 Marker 解读
| 现象 | 可能原因 | 下一步 |
|---|---|---|
| Marker 全在胶上、膜上没有 | 转膜时间/电流严重不足 | 延长转膜或加大电流 |
| 胶上 Marker 有残带，膜上完整 | 基本正常，部分残留正常 | 继续后续步骤 |
| Marker 在膜上变形模糊 | 转膜电流过高 | 降电流 |
| 只有高分子量 Marker 转到膜上 | 小蛋白穿膜了 | 转膜时间太长或膜孔径偏大 |
检测阶段的 Marker 解读
| 现象 | 可能原因 | 下一步 |
|---|---|---|
| 化学发光图上 Marker 完全看不到 | 用了预染/彩虹 Marker，它不带 HRP | 下次用化学发光 Marker |
| 预染 Marker 的染料遮挡了目标条带 | 目标条带和染料颜色重叠 | 选择目标区域避开彩色条带；或后续调整曝光时间 |
| 荧光 Marker 在某些通道有背景 | 染料光谱交叉 | 检查 Marker 说明书的通道兼容性 |
常见坑点
坑 1：彩虹 Marker 用来做化学发光曝光图的分子量标尺
彩虹 Marker 上的染料不是 HRP 标记的，化学发光不会让它显影。曝光图里看不到彩虹 Marker 很正常。如果你需要化学发光图上带分子量标尺，必须用专门的化学发光 Marker（如 PageRuler Prestained Protein Ladder 配合它的 Chemiluminescent Ladder，或单独买 HRP 标记 Marker）。
坑 2：Marker 条带跑不开，把目标条带挤没了
低浓度胶（4–6%）上高分子量 Marker 条带密集；高浓度胶（12–15%）上低分子量 Marker 条带密集。选胶浓度时要同时考虑目标蛋白和 Marker 范围。
| 目标蛋白分子量 | 推荐胶浓度 | 推荐 Marker 范围 |
|---|---|---|
| < 15 kDa | 12–15% | 3–200 kDa |
| 15–60 kDa | 10% | 10–250 kDa |
| 60–150 kDa | 8% | 15–250 kDa |
| > 150 kDa | 4–6% | 25–500 kDa |
坑 3：Marker 过期反复冻融
Marker 中的蛋白在反复冻融后会降解，条带变弱或出现新的杂带。正确做法：
- 收到后分装成小份（10–20 μL/管）
- -20°C 保存，每次用一管
- 避免反复冻融（最多 3 次）
坑 4：用 AFM / GAPDH 等内参作为 Marker 估算分子量
内参蛋白的分子量（GAPDH ~37 kDa、β-actin ~42 kDa）在 SDS-PAGE 中的迁移率和 Marker 蛋白不完全一致（因为氨基酸组成不同，电荷密度可能略有偏差）。准确估算分子量必须用 Protein Ladder。
一句话总结
化学发光检测首选彩虹 Marker + 化学发光 Marker 双 Marker 组合（前者监控电泳/转膜，后者给曝光图加标尺）；荧光检测用对应通道的荧光 Marker；小蛋白选低分子量范围 Marker（2–200 kDa），高分子量选宽范围 Marker（15–500 kDa）。 Marker 是 WB 成功与否最直观的反馈——电泳看它、转膜看它、曝光图也尽量让它可见。