为什么要自己算 MW 和 ε280
做表达纯化时，经常遇到这几个问题：
- 客户发你一个氨基酸序列，问你”这个蛋白大概多少 kDa？“——你拿计算器一个个加，半小时过去了
- 表达量不高，Bradford/BCA 测不准（低于最低检测限），但你只有 1 mL 样品，不想再稀释
- 做酶学实验需要精确的摩尔浓度（Molar Concentration），Bradford/BCA 测的是 µg/mL，还得再除以分子量
这时候，如果你知道蛋白的氨基酸序列，分子量（MW）和摩尔消光系数（ε280）都可以直接算出来。有了这两个数，再加上一个 NanoDrop 读数，就能精确算出摩尔浓度——不用标准曲线，不用额外试剂，5 分钟搞定。
第一部分：蛋白质分子量（MW）的三种计算方式
方法 1：逐一累加（手动，精确）
每种氨基酸有自己的残基分子量（Residue MW，注意：这是脱去一分子水后的 MW，因为肽键形成时脱 H₂O）。
| 氨基酸 | 单字母 | 残基 MW (Da) | 280 nm 吸收贡献 |
|---|---|---|---|
| Glycine | G | 57.05 | — |
| Alanine | A | 71.08 | — |
| Serine | S | 87.08 | — |
| Proline | P | 97.12 | — |
| Valine | V | 99.13 | — |
| Threonine | T | 101.11 | — |
| Cysteine | C | 103.15 | 250 M⁻¹ cm⁻¹（每对二硫键） |
| Leucine | L | 113.16 | — |
| Isoleucine | I | 113.16 | — |
| Asparagine | N | 114.10 | — |
| Aspartic Acid | D | 115.09 | — |
| Glutamine | Q | 128.13 | — |
| Lysine | K | 128.17 | — |
| Glutamic Acid | E | 129.12 | — |
| Methionine | M | 131.20 | — |
| Histidine | H | 137.14 | — |
| Phenylalanine | F | 147.18 | — |
| Arginine | R | 156.19 | — |
| Tyrosine | Y | 163.18 | 1490 M⁻¹ cm⁻¹（每个） |
| Tryptophan | W | 186.21 | 5500 M⁻¹ cm⁻¹（每个） |
计算公式：
蛋白 MW = Σ（各氨基酸残基数 × 对应残基 MW）+ 18.02末尾的 +18.02 是补上多肽链两端没有脱水的 H₂O（N 端的 -H 和 C 端的 -OH 合起来是一个 H₂O）。
例子：一个 100 aa 的蛋白，平均残基 MW 约 109 Da：
100 × 109 + 18 = 10918 Da ≈ 10.9 kDa方法 2：平均残基 MW 快速估算（5 秒得出数量级）
不想一个个加？用平均值：
| 条件 | 平均残基 MW | 适用 |
|---|---|---|
| 不含 Cys 的水溶性蛋白 | 110 Da | 大多数胞质蛋白 |
| 不含 Cys 的膜蛋白（疏水） | 112 Da | 整合膜蛋白 |
| 含 Cys 的蛋白（有二硫键） | 108 Da | 分泌蛋白、抗体 |
| 糖蛋白（糖基化贡献） | 再加 5–30% | 取决于糖链比例 |
快速估算公式：
MW ≈ aa 数 × 110 Da误差通常 <5%，足够判断 SDS-PAGE 上条带是否位置正确。
方法 3：工具自动计算
如果你手里有序列（FASTA 格式），可以直接用：
- BioHelper 分子量计算器（我们站上的工具）
- ProtParam（ExPASy 出品，还会顺便算 ε280、理论 pI、半衰期等）
- Protein Calculator v3.0（免费在线工具）
这些工具不仅算 MW，还会自动统计 Trp、Tyr、Cys 的数量，为下一步算 ε280 做准备。
注意 His-tag 影响：如果是带 6×His 标签的重组蛋白，MW 要加 ~0.84 kDa（6×His tag 的残基 MW）。带 MBP 标签的要加 ~42.5 kDa。
第二部分：摩尔消光系数 ε280 的经验公式
什么是摩尔消光系数
摩尔消光系数（Molar Extinction Coefficient，ε）是特定波长下，1 M 浓度、1 cm 光程的蛋白溶液的吸光度。单位是 M⁻¹ cm⁻¹。
在 280 nm，蛋白的吸收主要来自三种芳香/含硫氨基酸：
| 氨基酸 | 280 nm 吸收贡献 | 说明 |
|---|---|---|
| Trp（色氨酸） | 5500 M⁻¹ cm⁻¹ / 个 | 最大贡献者，每个 Trp 约占 70–80% 的吸收 |
| Tyr（酪氨酸） | 1490 M⁻¹ cm⁻¹ / 个 | 约占 20–25% |
| Cystine（二硫键） | 125 M⁻¹ cm⁻¹ / 对 | 贡献很小，但对无 Trp 的蛋白至关重要 |
ε280 估算公式
ε280 (M⁻¹ cm⁻¹) ≈ 5500 × n(Trp) + 1490 × n(Tyr) + 125 × n(Cystine)更精确的版本（Pace et al., 1995，常用经验值）：
ε280 ≈ 5500 × n(W) + 1490 × n(Y) + 125 × n(SS bond)ε280 估算示例
假设你表达的 GST 融合蛋白：
- 总 aa 数：约 260（GST 约 220 aa + 你的插入 40 aa）
- Trp 数量：GST 自己有 2 个 + 你的插入有 1 个 = 3 个
- Tyr 数量：GST 有 8 个 = 8 个
- 二硫键：胞质表达的 GST 没有二硫键 = 0 对
ε280 ≈ 5500 × 3 + 1490 × 8 + 125 × 0 ≈ 16500 + 11920 = 28420 M⁻¹ cm⁻¹ε280 实测 vs 估算：什么时候需要校正
估算值通常和实测值吻合度在 ±15% 以内，足够精确用于日常定量。但以下情况建议实测校正：
| 情况 | 影响 | 校正方法 |
|---|---|---|
| 蛋白有显著三级结构折叠 | 芳香基团被包埋，吸收降低 5–20% | 用变性蛋白（加 6 M 盐酸胍）重测 ε280 |
| 含血红素/辅因子 | 辅因子在 280 nm 有吸收干扰 | 减去辅因子贡献或用变性体系 |
| 糖基化严重 | 糖链本身不吸收，但影响光散射 | 用散射校正公式（见下） |
| 无 Trp 的蛋白 | ε280 极低，NanoDrop 读不准 | 改用 ε278 或用 BCA 兜底 |
第三部分：A280 直接定量实操
核心公式
知道了 ε280 和 MW，浓度直接算：
浓度 (M) = A280 / ε280
浓度 (µg/mL) = (A280 × MW / ε280) × 10^6这里的 MW 要换成 g/mol（数值上等于 Da 数，比如 10.9 kDa 就是 10900 g/mol）。
实操 checklist
| 步骤 | 操作 | 注意 |
|---|---|---|
| 1 | 用 NanoDrop 或 UV-Vis 读 A280 | 样品前必须离心去除颗粒 |
| 2 | 用洗脱缓冲液做空白 | 不要用水，缓冲液 pH 影响吸收 |
| 3 | 读 A260 算核酸污染比例 | 如果 A260/A280 > 0.6，需要校正 |
| 4 | 用公式算摩尔浓度 | 记得 MW 单位换算 |
| 5 | 如果有核酸污染，用校正公式 | 见下 |
核酸污染校正
如果蛋白样品中混有少量核酸（例如没有洗干净的表达纯化洗脱液），核酸在 260 nm 有强吸收，会干扰 A280 读数。A260/A280 比值是判断污染的最好指标：
| A260/A280 比值 | 污染程度 | 处理建议 |
|---|---|---|
| < 0.6 | 纯蛋白，无核酸 | 直接用 A280 计算 |
| 0.6–1.0 | 轻微核酸污染（< 5%） | 可直接用，误差可接受 |
| 1.0–1.5 | 明显核酸污染（5–20%） | 用校正公式扣除 |
| > 1.5 | 严重污染 | 重新过柱纯化或切胶回收 |
核酸污染校正公式（Warburg & Christian 法）：
蛋白 A280 校正值 = A280(实测) - 0.4 × A260这个 0.4 是经验系数：每 1 A260 单位的核酸在 280 nm 贡献约 0.4 的吸收。校正后再用校正值计算蛋白浓度。
光散射校正
如果样品中存在未溶解的蛋白聚集物，NanoDrop 读数会被光散射干扰（看起来 A280 偏高）。判断方法：读 A340（蛋白和核酸在 340 nm 都没有吸收）：
如果 A340 > 0.01 → 存在颗粒散射
校正后 A280 = A280(实测) - A340第四部分：A280 vs BCA vs Bradford — 怎么选
| 维度 | A280 直接定量 | BCA | Bradford |
|---|---|---|---|
| 需要标准品 | 否 | 是（BSA 0–2000 µg/mL） | 是（BSA 0–1500 µg/mL） |
| 浓度单位 | M 或 µg/mL | µg/mL | µg/mL |
| 最低检测限 | ~1–5 µg/mL | ~5–10 µg/mL | ~10–100 µg/mL |
| 去垢剂耐受 | 好（大多数去垢剂不干扰 UV） | 好（≤5% SDS） | 差（>0.1% SDS 严重干扰） |
| 还原剂干扰 | 无 | 有（>1 mM DTT 假阳性） | 轻微 |
| 必须知道序列 | 是 | 否 | 否 |
| 定量精度 | ±5–10%（有 ε280） | ±10–15% | ±15–20% |
| 对核酸污染敏感度 | 需要校正 | 轻微影响 | 轻微影响 |
| 适合场景 | 序列已知的纯化蛋白 | 裂解液、含去垢剂样品 | 快筛、无去垢剂样品 |
决策建议
你有已知序列的纯化蛋白？
├─ 是 → A280 直接定量（快、准、不消耗样品）
└─ 否 → 样品含去垢剂？
├─ 是 → BCA
└─ 否 → Bradford（更快）常见坑点
| 坑点 | 表现 | 根因 | 解决方案 |
|---|---|---|---|
| 浓度算出来和 BCA 差 2× | A280 算的值偏高或偏低 | ε280 估算值 vs 实测值有偏差 | 用同一批样品做一次 BCA 校准 ε280 |
| 无 Trp 的蛋白算不出 | ε280 ≈ 750–3000，读不准 | 吸收太弱，A280 接近检测限 | 用 ε278（Phe/Tyr 贡献）或改用 BCA |
| 含核酸的样品直接算 | A280 偏高 20–50% | 核酸在 280 nm 有吸收 | 先看 A260/A280，用校正公式 |
| His-tag 没算 MW | 浓度偏高约 10% | His-tag 的 840 Da 没加进去 | MW 别忘了 tag |
| 光散射没校正 | 所有波长都有背景吸收 | 样品里有聚集蛋白颗粒 | 离心后测 A340 校正，或 0.22 µm 过滤 |
| 使用不同缓冲液的空白 | A280 基线飘 | 缓冲液本身有 UV 吸收 | 洗脱缓冲液直接做空白 |
快速参考卡
【MW 快速估算】aa 数 × 110 Da
【ε280 估算】5500×W + 1490×Y + 125×二硫键对数
【A280→摩尔浓度】c (M) = A280 / ε280
【A280→µg/mL】c = A280 × MW / ε280 × 10⁶
【核酸污染校正】A280_corrected = A280 - 0.4 × A260
【光散射校正】A280_corrected = A280 - A340一句话总结
序列在手，10 秒算出 MW（aa×110），5 分钟算出 ε280（5500×W + 1490×Y + 125×二硫键），A280 读数直接算摩尔浓度。纯蛋白首选 A280，含去垢剂选 BCA，快筛用 Bradford。核酸污染扣 0.4×A260，光散射扣 A340。