蛋白质分子量、摩尔消光系数计算与 A280 直接定量：原理、公式与实操对照

为什么要自己算 MW 和 ε280

做表达纯化时，经常遇到这几个问题：

客户发你一个氨基酸序列，问你“这个蛋白大概多少 kDa？”——你拿计算器一个个加，半小时过去了
表达量不高，Bradford/BCA 测不准（低于最低检测限），但你只有 1 mL 样品，不想再稀释
做酶学实验需要精确的摩尔浓度（Molar Concentration），Bradford/BCA 测的是 µg/mL，还得再除以分子量

这时候，如果你知道蛋白的氨基酸序列，分子量（MW）和摩尔消光系数（ε280）都可以直接算出来。有了这两个数，再加上一个 NanoDrop 读数，就能精确算出摩尔浓度——不用标准曲线，不用额外试剂，5 分钟搞定。

第一部分：蛋白质分子量（MW）的三种计算方式

方法 1：逐一累加（手动，精确）

每种氨基酸有自己的残基分子量（Residue MW，注意：这是脱去一分子水后的 MW，因为肽键形成时脱 H₂O）。

氨基酸	单字母	残基 MW (Da)	280 nm 吸收贡献
Glycine	G	57.05	—
Alanine	A	71.08	—
Serine	S	87.08	—
Proline	P	97.12	—
Valine	V	99.13	—
Threonine	T	101.11	—
Cysteine	C	103.15	250 M⁻¹ cm⁻¹（每对二硫键）
Leucine	L	113.16	—
Isoleucine	I	113.16	—
Asparagine	N	114.10	—
Aspartic Acid	D	115.09	—
Glutamine	Q	128.13	—
Lysine	K	128.17	—
Glutamic Acid	E	129.12	—
Methionine	M	131.20	—
Histidine	H	137.14	—
Phenylalanine	F	147.18	—
Arginine	R	156.19	—
Tyrosine	Y	163.18	1490 M⁻¹ cm⁻¹（每个）
Tryptophan	W	186.21	5500 M⁻¹ cm⁻¹（每个）

计算公式：

蛋白 MW = Σ（各氨基酸残基数 × 对应残基 MW）+ 18.02

末尾的 +18.02 是补上多肽链两端没有脱水的 H₂O（N 端的 -H 和 C 端的 -OH 合起来是一个 H₂O）。

例子：一个 100 aa 的蛋白，平均残基 MW 约 109 Da：

100 × 109 + 18 = 10918 Da ≈ 10.9 kDa

方法 2：平均残基 MW 快速估算（5 秒得出数量级）

不想一个个加？用平均值：

条件	平均残基 MW	适用
不含 Cys 的水溶性蛋白	110 Da	大多数胞质蛋白
不含 Cys 的膜蛋白（疏水）	112 Da	整合膜蛋白
含 Cys 的蛋白（有二硫键）	108 Da	分泌蛋白、抗体
糖蛋白（糖基化贡献）	再加 5–30%	取决于糖链比例

快速估算公式：

MW ≈ aa 数 × 110 Da

误差通常 <5%，足够判断 SDS-PAGE 上条带是否位置正确。

方法 3：工具自动计算

如果你手里有序列（FASTA 格式），可以直接用：

BioHelper 分子量计算器（我们站上的工具）
ProtParam（ExPASy 出品，还会顺便算 ε280、理论 pI、半衰期等）
Protein Calculator v3.0（免费在线工具）

这些工具不仅算 MW，还会自动统计 Trp、Tyr、Cys 的数量，为下一步算 ε280 做准备。

注意 His-tag 影响：如果是带 6×His 标签的重组蛋白，MW 要加 ~0.84 kDa（6×His tag 的残基 MW）。带 MBP 标签的要加 ~42.5 kDa。

第二部分：摩尔消光系数 ε280 的经验公式

什么是摩尔消光系数

摩尔消光系数（Molar Extinction Coefficient，ε）是特定波长下，1 M 浓度、1 cm 光程的蛋白溶液的吸光度。单位是 M⁻¹ cm⁻¹。

在 280 nm，蛋白的吸收主要来自三种芳香/含硫氨基酸：

氨基酸	280 nm 吸收贡献	说明
Trp（色氨酸）	5500 M⁻¹ cm⁻¹ / 个	最大贡献者，每个 Trp 约占 70–80% 的吸收
Tyr（酪氨酸）	1490 M⁻¹ cm⁻¹ / 个	约占 20–25%
Cystine（二硫键）	125 M⁻¹ cm⁻¹ / 对	贡献很小，但对无 Trp 的蛋白至关重要

ε280 估算公式

ε280 (M⁻¹ cm⁻¹) ≈ 5500 × n(Trp) + 1490 × n(Tyr) + 125 × n(Cystine)

更精确的版本（Pace et al., 1995，常用经验值）：

ε280 ≈ 5500 × n(W) + 1490 × n(Y) + 125 × n(SS bond)

ε280 估算示例

假设你表达的 GST 融合蛋白：

总 aa 数：约 260（GST 约 220 aa + 你的插入 40 aa）
Trp 数量：GST 自己有 2 个 + 你的插入有 1 个 = 3 个
Tyr 数量：GST 有 8 个 = 8 个
二硫键：胞质表达的 GST 没有二硫键 = 0 对

ε280 ≈ 5500 × 3 + 1490 × 8 + 125 × 0 ≈ 16500 + 11920 = 28420 M⁻¹ cm⁻¹

ε280 实测 vs 估算：什么时候需要校正

估算值通常和实测值吻合度在 ±15% 以内，足够精确用于日常定量。但以下情况建议实测校正：

情况	影响	校正方法
蛋白有显著三级结构折叠	芳香基团被包埋，吸收降低 5–20%	用变性蛋白（加 6 M 盐酸胍）重测 ε280
含血红素/辅因子	辅因子在 280 nm 有吸收干扰	减去辅因子贡献或用变性体系
糖基化严重	糖链本身不吸收，但影响光散射	用散射校正公式（见下）
无 Trp 的蛋白	ε280 极低，NanoDrop 读不准	改用 ε278 或用 BCA 兜底

第三部分：A280 直接定量实操

核心公式

知道了 ε280 和 MW，浓度直接算：

浓度 (M) = A280 / ε280
浓度 (µg/mL) = (A280 × MW / ε280) × 10^6

这里的 MW 要换成 g/mol（数值上等于 Da 数，比如 10.9 kDa 就是 10900 g/mol）。

实操 checklist

步骤	操作	注意
1	用 NanoDrop 或 UV-Vis 读 A280	样品前必须离心去除颗粒
2	用洗脱缓冲液做空白	不要用水，缓冲液 pH 影响吸收
3	读 A260 算核酸污染比例	如果 A260/A280 > 0.6，需要校正
4	用公式算摩尔浓度	记得 MW 单位换算
5	如果有核酸污染，用校正公式	见下

核酸污染校正

如果蛋白样品中混有少量核酸（例如没有洗干净的表达纯化洗脱液），核酸在 260 nm 有强吸收，会干扰 A280 读数。A260/A280 比值是判断污染的最好指标：

A260/A280 比值	污染程度	处理建议
< 0.6	纯蛋白，无核酸	直接用 A280 计算
0.6–1.0	轻微核酸污染（< 5%）	可直接用，误差可接受
1.0–1.5	明显核酸污染（5–20%）	用校正公式扣除
> 1.5	严重污染	重新过柱纯化或切胶回收

核酸污染校正公式（Warburg & Christian 法）：

蛋白 A280 校正值 = A280(实测) - 0.4 × A260

这个 0.4 是经验系数：每 1 A260 单位的核酸在 280 nm 贡献约 0.4 的吸收。校正后再用校正值计算蛋白浓度。

光散射校正

如果样品中存在未溶解的蛋白聚集物，NanoDrop 读数会被光散射干扰（看起来 A280 偏高）。判断方法：读 A340（蛋白和核酸在 340 nm 都没有吸收）：

如果 A340 > 0.01 → 存在颗粒散射
校正后 A280 = A280(实测) - A340

第四部分：A280 vs BCA vs Bradford — 怎么选

维度	A280 直接定量	BCA	Bradford
需要标准品	否	是（BSA 0–2000 µg/mL）	是（BSA 0–1500 µg/mL）
浓度单位	M 或 µg/mL	µg/mL	µg/mL
最低检测限	~1–5 µg/mL	~5–10 µg/mL	~10–100 µg/mL
去垢剂耐受	好（大多数去垢剂不干扰 UV）	好（≤5% SDS）	差（>0.1% SDS 严重干扰）
还原剂干扰	无	有（>1 mM DTT 假阳性）	轻微
必须知道序列	是	否	否
定量精度	±5–10%（有 ε280）	±10–15%	±15–20%
对核酸污染敏感度	需要校正	轻微影响	轻微影响
适合场景	序列已知的纯化蛋白	裂解液、含去垢剂样品	快筛、无去垢剂样品

决策建议

你有已知序列的纯化蛋白？
├─ 是 → A280 直接定量（快、准、不消耗样品）
└─ 否 → 样品含去垢剂？
    ├─ 是 → BCA
    └─ 否 → Bradford（更快）

常见坑点

坑点	表现	根因	解决方案
浓度算出来和 BCA 差 2×	A280 算的值偏高或偏低	ε280 估算值 vs 实测值有偏差	用同一批样品做一次 BCA 校准 ε280
无 Trp 的蛋白算不出	ε280 ≈ 750–3000，读不准	吸收太弱，A280 接近检测限	用 ε278（Phe/Tyr 贡献）或改用 BCA
含核酸的样品直接算	A280 偏高 20–50%	核酸在 280 nm 有吸收	先看 A260/A280，用校正公式
His-tag 没算 MW	浓度偏高约 10%	His-tag 的 840 Da 没加进去	MW 别忘了 tag
光散射没校正	所有波长都有背景吸收	样品里有聚集蛋白颗粒	离心后测 A340 校正，或 0.22 µm 过滤
使用不同缓冲液的空白	A280 基线飘	缓冲液本身有 UV 吸收	洗脱缓冲液直接做空白

快速参考卡

【MW 快速估算】aa 数 × 110 Da
【ε280 估算】5500×W + 1490×Y + 125×二硫键对数
【A280→摩尔浓度】c (M) = A280 / ε280
【A280→µg/mL】c = A280 × MW / ε280 × 10⁶
【核酸污染校正】A280_corrected = A280 - 0.4 × A260
【光散射校正】A280_corrected = A280 - A340