按分子量选胶浓度（先看这个，不要上来就 12%）
| 目标蛋白大小 | 推荐分离胶浓度 | 备注 |
|---|---|---|
| >150 kD（大蛋白：如 EGFR 175 kD、mTOR 289 kD） | 6–8% | 注意转膜时间加长 |
| 80–150 kD（中等大：如 GAPDH 36 kD 不用在这里） | 8–10% | 最常用 |
| 30–80 kD（最常见区间：GAPDH 36、Tubulin 55、Actin 42、p53 53） | 10–12% | WB 默认 12% 不出错 |
| 15–30 kD（小蛋白：Histone、Rho、Caspase 片段） | 12–15% | 转膜时间缩短 |
| <15 kD（肽段、Caspase 切割产物） | 15–16% Tris-Tricine 系统 | 常规 Tris-Glycine 小条带跑出胶外 |
| 需要一次分离多种分子量大跨度 | 4–15% / 4–20% 梯度胶 | 推荐买预制胶，自制梯度需梯度混合仪 |
一句话：目标蛋白越大 → 胶越稀；蛋白越小 → 胶越浓。
试剂准备
核心储液（4°C 保存，可长期使用 3 个月）：
- 30% Acr-Bis（29:1）：29 g 丙烯酰胺 + 1 g 甲叉双丙烯酰胺溶于 100 mL ddH₂O，滤纸过滤避光
- 1.5 M Tris·Cl pH 8.8（分离胶缓冲液）
- 0.5 M Tris·Cl pH 6.8（浓缩胶缓冲液）
- 10% SDS（w/v）
- 10% APS（过硫酸铵）：必须现用现配或 -20°C 分装 ≤1 周，失效是胶不凝的头号元凶
- TEMED：4°C 避光保存，开瓶 6 个月后活性下降
安全：丙烯酰胺单体是神经毒素，全程戴手套；聚合后无毒。
精确配方表（全部按 1 块胶算，双板 ×2）
市面上小型垂直电泳槽（如 Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra）最常见三种玻璃板厚度，下面覆盖。
分离胶配方（体积 mL）
| 分离胶浓度 | 8% | 10% | 12% | 15% |
|---|---|---|---|---|
| 0.75 mm 小板（约需 5 mL） | ||||
| ddH₂O | 2.25 | 1.90 | 1.55 | 1.00 |
| 30% Acr-Bis | 1.35 | 1.65 | 2.00 | 2.50 |
| 1.5 M Tris pH 8.8 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 |
| 10% SDS | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 10% APS | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| TEMED | 0.003（3 µL） | 0.003 | 0.003 | 0.003 |
| 1.0 mm 小板（约需 6.5 mL） | ||||
| ddH₂O | 2.95 | 2.45 | 1.95 | 1.30 |
| 30% Acr-Bis | 1.75 | 2.15 | 2.60 | 3.25 |
| 1.5 M Tris pH 8.8 | 1.60 | 1.60 | 1.60 | 1.60 |
| 10% SDS | 0.065 | 0.065 | 0.065 | 0.065 |
| 10% APS / TEMED | 0.065 / 4 µL | 0.065 / 4 µL | 0.065 / 4 µL | 0.065 / 4 µL |
| 1.5 mm 小板（约需 8.5 mL） | ||||
| ddH₂O | 3.85 | 3.20 | 2.55 | 1.70 |
| 30% Acr-Bis | 2.25 | 2.80 | 3.40 | 4.25 |
| 1.5 M Tris pH 8.8 | 2.10 | 2.10 | 2.10 | 2.10 |
| 10% SDS | 0.085 | 0.085 | 0.085 | 0.085 |
| 10% APS / TEMED | 0.085 / 5 µL | 0.085 / 5 µL | 0.085 / 5 µL | 0.085 / 5 µL |
5% 浓缩胶配方（顶部约 1.5 cm 高度）
| 浓缩胶 | 0.75 mm（~2 mL） | 1.0 mm（~2.5 mL） | 1.5 mm（~3.5 mL） |
|---|---|---|---|
| ddH₂O | 1.35 | 1.70 | 2.38 |
| 30% Acr-Bis | 0.33 | 0.42 | 0.58 |
| 0.5 M Tris pH 6.8 | 0.25 | 0.31 | 0.44 |
| 10% SDS | 0.02 | 0.025 | 0.035 |
| 10% APS | 0.02 | 0.025 | 0.035 |
| TEMED | 2 µL | 2.5 µL | 3.5 µL |
标准化制胶流程
- 装板：将长短玻璃板对齐放入制胶架，拧紧夹件 → 底部灌蒸馏水检漏 1 分钟，无水珠渗漏再继续
- 配分离胶：按表量取 ddH₂O、Acr-Bis、Tris、SDS 混匀，最后加 APS 和 TEMED（加完会开始聚合，手要快）
- 灌分离胶：沿玻璃板内壁缓缓加入，灌至距离短玻璃板顶部 2.5 cm（预留浓缩胶空间）
- 封水相：在胶顶缓慢叠加 1 mL ddH₂O 或正丁醇，封液面防止胶面凹陷、排除边缘气泡
- 等待聚合：室温 25–30 分钟（胶体聚合会看到水相下方出现清晰折射界面）
- 去封层：倒去水相，用滤纸条吸干残留（不要碰到胶面）
- 配浓缩胶 + 插梳：配好浓缩胶立即灌入，将梳子以 45° 斜插入（减少气泡），插到底后缓慢放平，室温聚合 20 分钟
- 装槽：拔梳子时缓慢垂直向上，用注射器对着孔位打 1× 电泳缓冲液冲洗梳孔碎胶
跑胶参数参考
1× 电泳缓冲液（Tris 3 g + Glycine 14.4 g + SDS 1 g → 加水到 1 L，pH ≈ 8.3，不用调）
| 设备 | 起始 | 溴酚蓝跑入分离胶后 | 总时长 |
|---|---|---|---|
| Mini-PROTEAN（1.0 mm） | 80 V 恒压 20 min | 120 V 恒压至溴酚蓝到胶底 | ~60 分钟 |
| Mini-PROTEAN（1.5 mm） | 80 V 25 min | 140 V 至结束 | ~75 分钟 |
| 中大型电泳槽 | 60 V 30 min | 110–130 V | ~90 分钟 |
溴酚蓝在不同浓度凝胶中的对应分子量（注意这只是近似值，不要当真）：
- 10% 胶：溴酚蓝约对应 10–15 kD
- 12% 胶：溴酚蓝约对应 6–10 kD
- 小蛋白（<20 kD）不要跑到溴酚蓝出胶底
7 个常见问题与根因
1. 分离胶不凝或聚合非常慢（>40 分钟）
- 90% 是 APS 失效：重新配制 10% APS，或 APS 加量翻倍（如 50 µL → 100 µL/10 mL）
- 其次是 TEMED 过期 / 加量太少
- 温度低于 20°C：把制胶架移入 37°C 孵箱，聚合速度 +2 倍
- SDS 储液析出：37°C 水浴加热溶解摇匀再用
2. 胶凝固太快（加完 TEMED 还没灌就凝了）
- APS 或 TEMED 加量过多：上述配方是标准量
- 室温 >30°C：把缓冲液放冰盒里，APS/TEMED 临灌前最后 10 秒才加
- Acr-Bis 沉淀/析出（久置试剂）：换一瓶新的
3. 胶面凹陷或一边高一边低
- 封水相时加水太猛：应沿侧壁缓慢滴加，不要直接冲胶面
- 制胶架未放平：放个水平仪
- 玻璃板没夹平（长短玻璃之间错开）：重新装板
4. 梳孔有气泡，孔位变形
- 插梳太快、直插：改为 45° 斜插
- 浓缩胶加 APS/TEMED 后放了太久再插：应立即插
- 梳子有脏东西：用酒精棉擦干净，梳子齿有划痕会带气泡
5. 电泳时条带拖尾（不是上样问题）
- Acr-Bis 试剂过期：单体不纯 → 聚合不均匀
- 胶聚合不足：聚合 20 分钟就跑 → 建议至少 30 分钟，或者头天晚上灌胶封口保湿过夜
- 电泳缓冲液用太多次（>3 次）：换新缓冲液
6. 电泳时胶从玻璃板上脱落
- 玻璃板没有彻底洗干净：残留蛋白/去污剂
- 封水相用了太多正丁醇：对边缘胶层有一定损伤，改用水封就好
7. 小蛋白<20 kD 跑不出条带或跑出胶外
- 分离胶浓度不够：改 15% 或 Tris-Tricine
- 溴酚蓝跑过头：看到溴酚蓝出胶底即停止
- 搭配 0.2 µm NC 膜（0.45 µm 对 <30 kD 蛋白损失严重）+ 湿转 100 V 30 min
预制胶 vs 自制胶
| 维度 | 自制胶 | 预制胶（Bio-Rad / Thermo） |
|---|---|---|
| 成本 | 2–5 元 / 块 | 25–50 元 / 块 |
| 一致性 | 取决于手法，新手批次差异大 | 好，批次间 CV <5% |
| 梯度胶 / 特殊浓度 | 难做 | 丰富 |
| 存放时间 | 2–3 天（保湿袋 4°C） | 6–12 个月 |
| 时间 | 1.5 小时/批 | 即拆即用 |
建议：日常实验室、做 WB 量大 → 自制胶，省成本又方便；定量 Western、核心数据、梯度胶 → 预制胶。
相关工具
继续用工具完成条件判断和计算
本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。