按分子量选胶浓度（先看这个，不要上来就 12%）
| 目标蛋白大小 | 推荐分离胶浓度 | 备注 |
|---|---|---|
| >150 kD（大蛋白：如 EGFR 175 kD、mTOR 289 kD） | 6–8% | 注意转膜时间加长 |
| 80–150 kD（中等大：如 GAPDH 36 kD 不用在这里） | 8–10% | 最常用 |
| 30–80 kD（最常见区间：GAPDH 36、Tubulin 55、Actin 42、p53 53） | 10–12% | WB 默认 12% 不出错 |
| 15–30 kD（小蛋白：Histone、Rho、Caspase 片段） | 12–15% | 转膜时间缩短 |
| <15 kD（肽段、Caspase 切割产物） | 15–16% Tris-Tricine 系统 | 常规 Tris-Glycine 小条带跑出胶外 |
| 需要一次分离多种分子量大跨度 | 4–15% / 4–20% 梯度胶 | 推荐买预制胶，自制梯度需梯度混合仪 |
一句话：目标蛋白越大 → 胶越稀；蛋白越小 → 胶越浓。
试剂准备
核心储液（4°C 保存，可长期使用 3 个月）：
- 30% Acr-Bis（29:1）：29 g 丙烯酰胺 + 1 g 甲叉双丙烯酰胺溶于 100 mL ddH₂O，滤纸过滤避光
- 1.5 M Tris·Cl pH 8.8（分离胶缓冲液）
- 0.5 M Tris·Cl pH 6.8（浓缩胶缓冲液）
- 10% SDS（w/v）
- 10% APS（过硫酸铵）：必须现用现配或 -20°C 分装 ≤1 周，失效是胶不凝的头号元凶
- TEMED：4°C 避光保存，开瓶 6 个月后活性下降
安全：未聚合的丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液有神经毒性。配胶、清理溢出物及处理用过的凝胶时遵循实验室的个人防护和废弃物流程，不能把“已聚合”直接等同于“无需防护”。参见 Bio-Rad 手工制胶安全提示。
精确配方表（全部按 1 块胶算，双板 ×2）
市面上小型垂直电泳槽（如 Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra）最常见三种玻璃板厚度，下面覆盖。
分离胶配方（体积 mL）
| 分离胶浓度 | 8% | 10% | 12% | 15% |
|---|---|---|---|---|
| 0.75 mm 小板（约需 5 mL） | ||||
| ddH₂O | 2.25 | 1.90 | 1.55 | 1.00 |
| 30% Acr-Bis | 1.35 | 1.65 | 2.00 | 2.50 |
| 1.5 M Tris pH 8.8 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 |
| 10% SDS | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 10% APS | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| TEMED | 0.003（3 µL） | 0.003 | 0.003 | 0.003 |
| 1.0 mm 小板（约需 6.5 mL） | ||||
| ddH₂O | 2.95 | 2.45 | 1.95 | 1.30 |
| 30% Acr-Bis | 1.75 | 2.15 | 2.60 | 3.25 |
| 1.5 M Tris pH 8.8 | 1.60 | 1.60 | 1.60 | 1.60 |
| 10% SDS | 0.065 | 0.065 | 0.065 | 0.065 |
| 10% APS / TEMED | 0.065 / 4 µL | 0.065 / 4 µL | 0.065 / 4 µL | 0.065 / 4 µL |
| 1.5 mm 小板（约需 8.5 mL） | ||||
| ddH₂O | 3.85 | 3.20 | 2.55 | 1.70 |
| 30% Acr-Bis | 2.25 | 2.80 | 3.40 | 4.25 |
| 1.5 M Tris pH 8.8 | 2.10 | 2.10 | 2.10 | 2.10 |
| 10% SDS | 0.085 | 0.085 | 0.085 | 0.085 |
| 10% APS / TEMED | 0.085 / 5 µL | 0.085 / 5 µL | 0.085 / 5 µL | 0.085 / 5 µL |
5% 浓缩胶配方（顶部约 1.5 cm 高度）
| 浓缩胶 | 0.75 mm（~2 mL） | 1.0 mm（~2.5 mL） | 1.5 mm（~3.5 mL） |
|---|---|---|---|
| ddH₂O | 1.35 | 1.70 | 2.38 |
| 30% Acr-Bis | 0.33 | 0.42 | 0.58 |
| 0.5 M Tris pH 6.8 | 0.25 | 0.31 | 0.44 |
| 10% SDS | 0.02 | 0.025 | 0.035 |
| 10% APS | 0.02 | 0.025 | 0.035 |
| TEMED | 2 µL | 2.5 µL | 3.5 µL |
标准化制胶流程
- 装板：将长短玻璃板对齐放入制胶架，拧紧夹件 → 底部灌蒸馏水检漏 1 分钟，无水珠渗漏再继续
- 配分离胶：按表量取 ddH₂O、Acr-Bis、Tris、SDS 混匀，最后加 APS 和 TEMED（加完会开始聚合，手要快）
- 灌分离胶：沿玻璃板内壁缓缓加入，灌至距离短玻璃板顶部 2.5 cm（预留浓缩胶空间）
- 封水相：在胶顶缓慢叠加 1 mL ddH₂O 或正丁醇，封液面防止胶面凹陷、排除边缘气泡
- 等待聚合：室温 25–30 分钟（胶体聚合会看到水相下方出现清晰折射界面）
- 去封层：倒去水相，用滤纸条吸干残留（不要碰到胶面）
- 配浓缩胶 + 插梳：配好浓缩胶立即灌入，将梳子以 45° 斜插入（减少气泡），插到底后缓慢放平，室温聚合 20 分钟
- 装槽：拔梳子时缓慢垂直向上，用注射器对着孔位打 1× 电泳缓冲液冲洗梳孔碎胶
跑胶参数参考
1× 电泳缓冲液（Tris 3 g + Glycine 14.4 g + SDS 1 g → 加水到 1 L，pH ≈ 8.3，不用调）
| 设备 | 起始 | 溴酚蓝跑入分离胶后 | 总时长 |
|---|---|---|---|
| Mini-PROTEAN（1.0 mm） | 80 V 恒压 20 min | 120 V 恒压至溴酚蓝到胶底 | ~60 分钟 |
| Mini-PROTEAN（1.5 mm） | 80 V 25 min | 140 V 至结束 | ~75 分钟 |
| 中大型电泳槽 | 60 V 30 min | 110–130 V | ~90 分钟 |
溴酚蓝在不同浓度凝胶中的对应分子量（注意这只是近似值，不要当真）：
- 10% 胶：溴酚蓝约对应 10–15 kD
- 12% 胶：溴酚蓝约对应 6–10 kD
- 小蛋白（<20 kD）不要跑到溴酚蓝出胶底
7 个常见问题与根因
1. 分离胶不凝或聚合非常慢（>40 分钟）
- 90% 是 APS 失效：重新配制 10% APS，或 APS 加量翻倍（如 50 µL → 100 µL/10 mL）
- 其次是 TEMED 过期 / 加量太少
- 温度低于 20°C：把制胶架移入 37°C 孵箱，聚合速度 +2 倍
- SDS 储液析出：37°C 水浴加热溶解摇匀再用
2. 胶凝固太快（加完 TEMED 还没灌就凝了）
- APS 或 TEMED 加量过多：上述配方是标准量
- 室温 >30°C：把缓冲液放冰盒里，APS/TEMED 临灌前最后 10 秒才加
- Acr-Bis 沉淀/析出（久置试剂）：换一瓶新的
3. 胶面凹陷或一边高一边低
- 封水相时加水太猛：应沿侧壁缓慢滴加，不要直接冲胶面
- 制胶架未放平：放个水平仪
- 玻璃板没夹平（长短玻璃之间错开）：重新装板
4. 梳孔有气泡，孔位变形
- 插梳太快、直插：改为 45° 斜插
- 浓缩胶加 APS/TEMED 后放了太久再插：应立即插
- 梳子有脏东西：用酒精棉擦干净，梳子齿有划痕会带气泡
5. 电泳时条带拖尾（不是上样问题）
- Acr-Bis 试剂过期：单体不纯 → 聚合不均匀
- 胶聚合不足：聚合 20 分钟就跑 → 建议至少 30 分钟，或者头天晚上灌胶封口保湿过夜
- 电泳缓冲液用太多次（>3 次）：换新缓冲液
6. 电泳时胶从玻璃板上脱落
- 玻璃板没有彻底洗干净：残留蛋白/去污剂
- 封水相用了太多正丁醇：对边缘胶层有一定损伤，改用水封就好
7. 小蛋白<20 kD 跑不出条带或跑出胶外
- 分离胶浓度不够：改 15% 或 Tris-Tricine
- 溴酚蓝跑过头：看到溴酚蓝出胶底即停止
- 搭配 0.2 µm NC 膜（0.45 µm 对 <30 kD 蛋白损失严重）+ 湿转 100 V 30 min
预制胶 vs 自制胶
| 维度 | 自制胶 | 预制胶（Bio-Rad / Thermo） |
|---|---|---|
| 成本 | 2–5 元 / 块 | 25–50 元 / 块 |
| 一致性 | 取决于手法，新手批次差异大 | 好，批次间 CV <5% |
| 梯度胶 / 特殊浓度 | 难做 | 丰富 |
| 存放时间 | 2–3 天（保湿袋 4°C） | 6–12 个月 |
| 时间 | 1.5 小时/批 | 即拆即用 |
建议：日常实验室、做 WB 量大 → 自制胶，省成本又方便；定量 Western、核心数据、梯度胶 → 预制胶。
相关工具
继续用工具完成条件判断和计算
本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。
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