qPCR 内参基因表达不稳定怎么办？

问题描述

qPCR 实验中，候选参考基因的 Ct 在处理组、批次或技术复孔之间变化，需要先区分真实生物学变化与加样、RNA 和反转录误差。不存在适用于所有实验的固定 Ct 差值界限。见 MIQE 指南。

可能原因

1. 内参基因选择不当

• 所选内参在不同处理条件下表达量发生变化
• 组织或细胞类型不适合使用该内参

2. 样本处理问题

• RNA 提取质量不一致
• 反转录效率差异
• 样本量不一致

3. PCR 扩增效率问题

• 内参基因引物扩增效率不在 90-110% 范围内
• 存在引物二聚体干扰

解决方案

1. 验证内参稳定性

• 使用 geNorm 或 NormFinder 软件评估内参稳定性
• 检测多个候选内参基因

2. 多个候选参考基因

GAPDH、ACTB、18S rRNA 等仅供候选，须在本实验的样本和处理条件下验证；不要按组织类型直接指定稳定内参。详见选择与验证流程。

3. 使用多个内参

• 对经验证的多个参考基因可采用几何平均归一化，数量由本实验数据决定
• 提高归一化的可靠性

排查步骤

1. 检测内参基因的熔解曲线，确认特异性
2. 检查内参引物的扩增效率
3. 重新评估内参选择
4. 考虑使用管家基因套餐或商品化内参检测试剂盒