先判断是真的回收低，还是“可扩增模板变少”
亚硫酸氢盐处理后常见的抱怨是“DNA 没了”，但这里要先区分两种情况：
- 物理回收量确实下降很多
- 总量看起来还行，但后续 PCR 很难扩增
前者更像纯化损失和样本降解，后者更像模板被破坏、片段变短或引物策略不匹配。
最常见的 4 个原因
起始 DNA 量太少
如果起始 DNA 已经接近试剂盒推荐下限，转化和纯化后的损失会被直接放大。
这类样本即使流程没错，后续也容易表现成“几乎没有模板”。
样本本身已降解
亚硫酸氢盐处理本身就比较伤 DNA。
如果处理前 DNA 已经断裂明显，转化后会更难保住可用片段。
纯化步骤损失大
洗脱体积太小、柱膜或磁珠回收不稳定、洗脱时间不够，都会让最终得率进一步下降。
很多时候不是转化本身失败，而是后处理把本来就不多的 DNA 又丢了一轮。
后续扩增片段设计过长
转化后的 DNA 通常更脆弱、片段更短。
如果后续 PCR 还按常规基因组 DNA 的思路去设计较长产物，很容易误判成“转化后完全没有模板”。
排查顺序
- 先回看处理前 DNA 的浓度、纯度和完整性
- 再核对起始量是否低于试剂盒建议范围
- 检查洗脱方式、洗脱体积和纯化步骤是否过于激进
- 最后再看后续 PCR 产物长度和引物设计是否适合转化后模板
实用建议
- 样本量紧张时，优先保证 DNA 质量，再考虑是否做甲基化检测
- 对转化后模板，后续验证片段尽量保持更短
- 不要只看浓度数字，更要看是否还能稳定扩增
什么时候需要重做
- 处理前 DNA 本身已明显降解
- 起始量长期低于建议范围
- 同批样本反复出现极低回收且流程记录无法排除操作损失
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本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。