为什么缓冲液配方这么重要
实验室缓冲液决定了 pH 是否稳定、离子强度是否合适、样品是否会降解。很多实验出问题，最后追溯到缓冲液配错了：
- Western 转膜效率低：可能是转膜缓冲液少加了甲醇或 SDS，导致蛋白迁移异常
- 核酸电泳无条带或拖尾：TAE/TBE 浓度配错、pH 偏差，会影响 DNA 迁移速率和分辨率
- 细胞洗过就死：PBS 渗透压不对、pH 过酸过碱，细胞在清洗过程中直接裂解或凋亡
- 蛋白提取不出：RIPA 裂解液缺少蛋白酶抑制剂或 NaCl 浓度过高，蛋白无法有效释放
因此，配缓冲液不是简单称重加水，而是要清楚每个组分的作用和适用场景。
细胞培养与洗涤类缓冲液
PBS（磷酸盐缓冲液）
核心作用：维持渗透压（≈ 290 mOsm）和 pH 7.4，用于洗涤细胞、稀释蛋白样品、免疫荧光实验。
| 组分 | 1× 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| NaCl | 8.0 g | 维持渗透压（主要贡献者） |
| KCl | 0.2 g | 提供钾离子，模拟细胞内环境 |
| Na₂HPO₄ | 1.44 g | 磷酸氢二钠，主要缓冲对 |
| KH₂PO₄ | 0.24 g | 磷酸二氢钾，另一缓冲对 |
注意事项：
- 调 pH 至 7.4（用 HCl 或 NaOH），定容后高压灭菌（121°C 15 min）
- 无菌操作的 PBS 配完后应分装，避免反复开盖污染
- 若用于细胞消化前洗涤，需 37°C 预热，避免冷应激
- 市面上有粉末装 PBS 片剂（如 Sigma P4417），1 片溶 100 mL 水即得 1× PBS，方便但成本较高
- 需要 10× 储备液时，按上述配方量 ×10 称量即可；但 10× PBS 易结晶，低温析出属正常，可室温或 37°C 溶解后使用
TBS（Tris 盐缓冲液）
核心作用：pH 稳定区间比 PBS 更广（pH 7.0–9.0），常用于 Western 封闭液稀释、抗体稀释、洗涤（代替 PBS 可减少磷酸背景干扰）。
| 组分 | 1× 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| NaCl | 8.0 g | 维持渗透压 |
| Tris base | 2.42 g | 三羟甲基氨基甲烷，Tris-HCl 缓冲对 |
注意事项：
- Tris base 溶于水后 pH 约 10.5，需用 浓 HCl 调 pH 至 7.6
- 温度对 Tris pH 影响很大：每升高 1°C，pH 下降约 0.03，因此务必在室温或 25°C 下调 pH
- TBST = TBS + 0.05%–0.1% Tween-20，是 Western Blot 最常用的洗涤缓冲液
核酸电泳缓冲液
TAE（Tris-醋酸-EDTA）
核心作用：DNA 琼脂糖凝胶电泳的运行缓冲液，缓冲容量低，适合常规片段分离。
| 组分 | 1× 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| Tris base | 4.84 g | pH 缓冲 |
| 冰醋酸 | 1.14 mL | 醋酸根离子，组成缓冲对 |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | 2 mL | 螯合 Mg²⁺，抑制核酸酶降解 DNA |
注意事项：
- 通常配 50× 储液（Tris 242 g + 冰醋酸 57.1 mL + 0.5 M EDTA 100 mL，加水到 1 L），使用时稀释 50 倍
- TAE 缓冲容量较低，电泳 2–3 次后应更换，否则 pH 偏移、条带变形（微笑条带）
- 与 TBE 对比：TAE 对超螺旋 DNA 分辨率更好，大片段（>1 kb）电泳速度更快；但缓冲容量不如 TBE
TBE（Tris-硼酸-EDTA）
核心作用：缓冲容量高，适合长时间电泳或小片段（<500 bp）高分辨率分离。
| 组分 | 0.5× 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| Tris base | 2.72 g | pH 缓冲 |
| 硼酸 | 1.38 g | 硼酸根离子，高缓冲容量 |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | 0.46 mL | 抑制核酸酶 |
注意事项：
- 通常配 5× 储液 稀释 10 倍使用（工作浓度 0.5×）
- TBE 中的硼酸能与琼脂糖形成复合物，影响 DNA 回收；如果后续要切胶回收 DNA，建议用 TAE
- 小片段（如 20–500 bp）的引物检测、SSR 标记等推荐用 TBE，分辨率更高
培养基类
LB（Luria-Bertani）液体培养基
核心作用：大肠杆菌等细菌培养最常用的培养基，用于摇菌扩增质粒、表达蛋白。
| 组分 | 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| 胰蛋白胨 (Tryptone) | 10 g | 提供氨基酸和氮源（酪蛋白胰酶消化物） |
| 酵母提取物 (Yeast Extract) | 5 g | 提供维生素、核苷酸、微量元素 |
| NaCl | 10 g | 维持渗透压 |
注意事项：
- 调 pH 至 7.0（用 NaOH），121°C 高压灭菌 15 min
- 加入抗生素时（如 Amp、Kan），必须待培养基冷却至 55°C 以下再加，否则抗生素会高温失效
- LB 固体平板：LB 配方中额外加入 15 g/L 琼脂粉，灭菌后倒板
- 菌体量需求大时可改用 TB（Terrific Broth）培养基，菌密度通常比 LB 高 2–4 倍
TB（Terrific Broth）液体培养基
核心作用：营养比 LB 更丰富，适合高密度细菌培养和重组蛋白表达。
| 组分 | 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| 胰蛋白胨 | 12 g | 氮源 |
| 酵母提取物 | 24 g | 丰富营养 |
| 甘油 | 4 mL | 碳源，防止乙酸积累 |
| K₂HPO₄ | 12.54 g | 磷酸缓冲体系（稳定 pH） |
| KH₂PO₄ | 2.31 g | 同上 |
注意事项：
- 磷酸盐需单独灭菌后混合（高压灭菌时 K₂HPO₄ 与培养基其他成分高温下可能发生反应导致沉淀）
- TB 的缓冲能力远强于 LB，培养 16–24 h 仍能维持 pH 稳定，菌密度 OD₆₀₀ 可达 8–15
裂解与储存类缓冲液
TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA, pH 8.0）
核心作用：最温和的核酸储存缓冲液，保护 DNA/RNA 不被核酸酶降解。
| 组分 | 1× 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | 10 mL | pH 8.0 时 DNA 溶解度最高 |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | 2 mL | 螯合金属离子，抑制 DNase/RNase |
注意事项：
- 用于 PCR 模板时，EDTA 浓度不能过高（>1 mM 可能抑制 Taq 酶活性）；推荐用 1:10 稀释的 TE（0.1× TE）或纯水洗脱
- RNA 样品若长期保存，建议换成 无 RNase 的 TE 或直接 -80°C 保存于 RNase-free 水中
RIPA 裂解液（1×）
核心作用：动植物组织/细胞的全蛋白提取裂解液，兼具非离子（NP-40/Triton X-100）和离子型（SDS、脱氧胆酸钠）去污剂，裂解彻底但蛋白易变性。
| 组分 | 1× 配方（1 L） | 作用 |
|---|---|---|
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | 50 mL | pH 稳定 |
| NaCl | 9 g | 150 mM NaCl，接近生理盐浓度，防止蛋白非特异结合 |
| NP-40 / Triton X-100 | 10 mL | 1% 非离子去污剂，溶解细胞膜 |
| 脱氧胆酸钠 | 5 g | 0.5% 离子型去污剂，裂解更强 |
| SDS | 1 g | 0.1% SDS，强变性剂，打破蛋白相互作用 |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | 2 mL | 螯合金属离子，抑制蛋白酶 |
注意事项：
- 使用前立即加入蛋白酶抑制剂：PMSF（1 mM，工作液现加，水溶液 1 h 内失效）+ 蛋白酶抑制剂 Cocktail
- 做 Co-IP、ChIP 等需要保持蛋白复合物完整性的实验，不能用 RIPA（太猛，会打断蛋白相互作用），应改用较温和的 NP-40 裂解液
- RIPA 裂解的蛋白样品不适合做酶活检测（SDS 会使酶变性失活）
常用浓缩储液
Tris-HCl（1 M, pH 8.0）
最基础的储液，几乎所有分子生物学缓冲液都用它来配制最终浓度。
- 配方：称 Tris base 121.14 g，加水 800 mL 溶解，用浓 HCl 调 pH 至 8.0（约需 42 mL），定容至 1 L
- 调 pH 技巧：Tris 溶于水 pH 约 10.5，pH 从 10.5 降至 8.0 过程中，接近 8.5 时要慢慢加 HCl，一不小心就过酸；如果不小心过酸，不能再回加强碱（盐浓度会过高），应弃去重配
EDTA（0.5 M, pH 8.0）
EDTA 是常见金属离子螯合剂，但 pH < 8 时几乎不溶，必须调 pH 才能溶解。
- 配方：称 EDTA·Na₂·2H₂O 186.12 g，加水 700 mL，用 NaOH 颗粒慢慢调 pH 到 8.0，边调边搅拌，待完全溶解后定容到 1 L
不同实验怎么选缓冲液
| 实验场景 | 推荐缓冲液 | 原因 |
|---|---|---|
| 细胞培养洗涤、胰酶前清洗 | PBS (1×) | 渗透压匹配，pH 7.4 |
| Western 洗涤、封闭、抗体稀释 | TBST (TBS + 0.1% Tween) | Tris 缓冲能力好，减少磷酸背景 |
| 琼脂糖凝胶电泳（常规） | TAE (1×) | 便宜、大片段速度快 |
| 琼脂糖凝胶电泳（小片段、高分辨率） | TBE (0.5×) | 缓冲容量高，条带更锐利 |
| 蛋白琼脂糖/聚丙烯酰胺电泳 | 电泳缓冲液（Tris-Glycine） | 甘氨酸-盐酸系统形成不连续 pH |
| 质粒提取、DNA 长期保存 | TE (pH 8.0) | EDTA 抑制 DNase |
| Western 蛋白提取（全蛋白） | RIPA + 蛋白酶抑制剂 | 裂解彻底、蛋白溶解度高 |
| Co-IP、ChIP 蛋白提取 | NP-40 裂解液（温和） | 不破环蛋白-蛋白/蛋白-DNA 相互作用 |
| 大肠杆菌摇菌扩增质粒 | LB | 便宜、足够用 |
| 大肠杆菌高密度表达重组蛋白 | TB | 营养丰富、缓冲能力强 |
缓冲液配制常见问题
1. 配完发现 pH 不对
Tris 类缓冲液调 pH 时务必在室温进行。低温下 Tris 的 pH 会偏高 0.3–0.5，此时按 7.4 调 pH，到室温后反而会过酸。
2. 10× PBS 放 4°C 析出结晶
PBS 10× 储液在 4°C 溶解度下降，磷酸氢二钠会结晶析出。室温或 37°C 水浴加热溶解即可，不影响使用。建议 PBS 储液常温保存。
3. RIPA 裂解后蛋白浓度太低
可能原因：
- 忘了加 PMSF（现用现加，提前 30 min 加的话已经水解完了）
- 裂解液与样品比例不对（细胞量太少，裂解液加太多）
- RIPA 中 SDS 比例过高，导致 BCA 定量不准（可用 Bradford 重新测）
4. TAE/TBE 电泳不出带或条带歪
- 缓冲液用太久（电泳 >3 次）：阴阳极 pH 梯度失衡
- 浓缩储液稀释错误：50× TAE 稀释到 1× 时取量算错、水加少了 → 可用 摩尔浓度换算工具 复核
- 琼脂糖凝胶和电泳槽用的缓冲液不一致（凝胶用 TAE、电泳槽倒了 TBE），离子强度不匹配导致条带变形
5. 高压灭菌后出现沉淀
Tris-HCl 和 EDTA 储液高压灭菌一般没问题。但 TB 培养基中的磷酸盐必须分开灭菌，否则高温下磷酸钾与蛋白胨中某些成分发生反应生成不溶性沉淀。
配方快速换算
实验室配制时体积不一定是 1 L，比如经常配 500 mL、200 mL、100 mL。各组分按目标体积 / 1000 等比换算即可。
例如：配制 500 mL PBS → NaCl 8 g × 0.5 = 4 g，KCl 0.2 g × 0.5 = 0.1 g，以此类推。
如果不想手工计算，可直接使用 常用缓冲液配方查询工具，输入目标体积后自动输出所有组分的用量，并自动完成 g↔mg、mL↔µL 的单位换算。