核酸降解排查：DNA 与 RNA 降解的识别与预防

核酸降解的典型表现

核酸降解在电泳图上的表现因严重程度而异，正确识别是排查的第一步。

RNA 降解

• 轻度降解：28S/18S 比值下降，28S 条带边缘模糊但仍可见
• 中度降解：28S 条带消失，18S 条带变宽变淡，5S 区堆积
• 重度降解：呈弥散 Smear，几乎无清晰条带

DNA 降解

• 轻度降解：主带下方出现轻微拖尾
• 中度降解：主带模糊，出现大量小片段拖尾
• 重度降解：主带消失，全孔弥散

关键判断：RNA 比 DNA 更容易降解，因为 RNase 极其稳定且广泛存在。DNA 降解多由机械剪切、DNase 污染或酸性条件导致。

原因一：操作引入的核酸酶污染

原因

RNase 广泛存在于皮肤、唾液、汗液中，耐高温且难以灭活。DNase 虽不如 RNase 顽固，但在某些组织样本中含量很高。未佩戴口罩、徒手接触管口、未使用滤芯枪头都是常见污染源。

排查

• 操作时是否佩戴口罩和手套（皮肤是 RNase 主要来源）
• 是否使用 RNase-free / DNase-free 的枪头和离心管
• 台面是否用 RNase 去除剂擦拭
• 试剂是否用 DEPC 水或无核酸酶水配制

处理

• 所有 RNA 操作全程佩戴口罩和双层手套
• 使用带滤芯枪头和 RNase-free 耗材
• 台面、移液器用 RNase Zap 或类似去除剂擦拭
• 所有溶液用 0.1% DEPC 水配制并高压灭菌（注意：Tris 缓冲液不能用 DEPC 处理）

原因二：样本采集与保存不当

原因

组织或细胞离体后内源性核酸酶立即开始降解核酸。若未及时稳定（液氮速冻、RNAlater 浸泡、蛋白酶抑制剂），降解在数分钟内就会发生。

排查

• 样本采集到冻存之间的时间间隔（应 < 10 分钟）
• 是否立即液氮速冻或浸入 RNAlater
• 冻存温度是否为 -80°C（-20°C 不足以抑制 RNase）
• 样本是否经历了反复冻融

处理

• 组织离体后 5 分钟内投入液氮速冻，转存 -80°C
• 或切成 < 0.5 cm 块后浸入 RNAlater（4°C 过夜渗透后转 -20°C）
• 分装保存避免反复冻融，每次取用一份
• 细胞样本先 PBS 洗涤，直接加裂解液裂解，避免冻存细胞直接提取

原因三：提取试剂污染或失效

原因

提取试剂盒的裂解液若被核酸酶污染、β-巯基乙醇失效、蛋白酶 K 活性下降，都会导致提取过程中核酸持续降解。

排查

• 裂解液是否现配并添加 β-巯基乙醇（RNA 提取必需）
• β-巯基乙醇添加后 4°C 保存不超过 1 个月
• 蛋白酶 K 是否在有效期内且储存温度正确（-20°C）
• 是否有外来核酸酶引入（共用试剂是隐患）

处理

• 裂解液现配现用，β-巯基乙醇新鲜添加（终浓度 1-2%）
• 蛋白酶 K 分装冻存，避免反复冻融
• RNA 提取专用试剂与 DNA 提取试剂分开存放
• 怀疑试剂污染时，用已知完整 RNA 做对照提取验证

原因四：电泳条件不当造成的假性降解

原因

有时电泳图呈现”降解样”弥散，实际核酸并未降解，而是电泳条件问题：凝胶过热、电压过高、上样量过大、缓冲液失效。

排查

• 电泳缓冲液是否重复使用超过 3 次（pH 和离子强度变化）
• 电压是否过高（建议 5-8 V/cm）
• 上样量是否过大（建议 200-500 ng/lane）
• 凝胶是否有熔化迹象（过热导致）

处理

• 更换新鲜 TAE 或 TBE 缓冲液
• 电压控制在 5-8 V/cm
• 上样量控制在 200-500 ng/lane
• RNA 电泳需用变性胶（含甲醛或乙二醛）才能准确反映完整性

排查顺序

1. 对照电泳：用已知完整的核酸样品同板电泳，排除电泳系统问题
2. 检查试剂：裂解液、β-巯基乙醇、蛋白酶 K 是否新鲜有效
3. 复盘操作：口罩、手套、滤芯枪头、RNase-free 耗材是否到位
4. 追溯样本：采集到冻存的时间、冻存温度、冻融次数
5. 仪器检测：有条件时用 Bioanalyzer 测 RIN 值（RNA）或 Fragment Analyzer（DNA）

RNA 降解分级处理

预防措施

• RNA 操作专区：专用移液器、耗材、试剂，与 DNA 操作区分
• 全程低温：样本处理在冰上完成，离心机预冷至 4°C
• 耗材 RNase-free：购买认证的 RNase-free 枪头和离心管，不要自行处理
• 分装保存：提取后的核酸分装多管，-80°C 保存，避免反复冻融
• 定期清洁：每月用 RNase 去除剂彻底清洁台面和设备
• 对照实验：每次提取都保留一个已知良好的对照样本