CFSE / CTV 增殖实验原理
CFSE（Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester）或 Thermo Fisher 出品的 CellTrace Violet（CTV，替代 CFSE 更稳定）是可透过细胞膜、不可逆结合胞内蛋白氨基的荧光染料。标记后细胞每分裂一次，胞内荧光强度恰好减半，因此在流式的 FITC（CFSE）或 Pacific Blue（CTV）通道的直方图上会出现一系列”阶梯状”的等间距稀释峰：
- 第 0 代（未分裂）：荧光最强，在最右端
- 第 1 代：荧光减半，左移一个阶梯
- 第 2 代：再次减半，继续左移
- ……依次类推，通常能清晰区分到 6–8 代
相比 CCK-8 / MTT / BrdU 方法，CFSE/CTV 的优势在于：
- 不仅知道”有没有增殖”，还能知道每个细胞具体分了几代，能量化分裂不均一性（部分细胞分 5 代、部分细胞 1 代都不分）
- 可以与表面标记（CD4/CD8 等）联合，区分不同亚群的增殖差异
- 一次标记可追踪 5–7 天
染色与实验的关键操作要点
虽然本文聚焦数据分析，但染色操作的质量直接决定分析是否可行：
1. CFSE / CTV 工作液浓度
| 染料 | 推荐工作浓度 | 染色时间/温度 | 通道 |
|---|---|---|---|
| CFSE | 1–5 µM（常用 2.5 µM） | 37°C 避光 10 min | FITC（488 nm 激发，530/30） |
| CellTrace Violet (CTV) | 0.5–2.5 µM（常用 1 µM） | 37°C 避光 20 min | Pacific Blue（405 nm 激发，450/50） |
浓度是最大的坑：浓度太高会导致本代峰超出线性范围，甚至细胞毒性；太低则 5–6 代后峰与自发荧光重叠分不清。建议正式实验前做一个浓度梯度预实验（0.5、1、2.5、5 µM），选能看到 5 个以上清晰峰、且细胞无明显死亡的浓度。
2. 染色终止方法
加与染色液等体积的胎牛血清（FBS） 终止 5 min，让游离的染料被血清蛋白吸附消耗。然后用完全培养基洗两次，避免未结合染料残留。
3. 必须有”未分裂对照”（T0 对照）
单独设一管，染色后立即固定 / 立即上机，不经过培养。这管作为：
- 第 0 代峰的位置锚点，后续样品第 0 代和它对齐
- 检查染色是否成功（单峰对称，CV 小）
4. 补偿对照
如果同时染表面标记（CD4-PE、CD8-APC 等），需要做补偿：
- 空白未染管
- CFSE 单染管（或 CTV 单染管）
- 各表面荧光单染管（CompBeads 补偿微球效果更好）
FlowJo 分析完整步骤
第 1 步：补偿调节（如果多色）
- 拖入 CompBeads 单染管 → 打开 Compensation Wizard
- 按向导完成各通道补偿矩阵计算
- Apply to all samples，确保所有样品应用同一矩阵
如果是单色 CFSE 实验（只有 CFSE + FSC/SSC），可以跳过这一步。
第 2 步：圈门三部曲
和其他流式实验一致，依次建立三个门：
| 门 | X × Y 轴 | 圈什么 | 目的 |
|---|---|---|---|
| Gate 1: Events | FSC-A × SSC-A | 主细胞群 | 去碎片、杂质 |
| Gate 2: Single Cells | FSC-A × FSC-H（或 FSC-A × FSC-W） | 对角线上的窄带单细胞 | 排除粘连细胞，避免误判为”未分裂的双倍荧光” |
| Gate 3: Live Cells（可选） | 死活染料通道 或 FSC-A × SSC-A 的高 FSC 区 | 活细胞群 | 如果做了 3–5 天的长时培养，死细胞碎片会很多，必须圈活细胞 |
第 3 步：定位 CFSE 峰（直方图）
在 Single Cells / Live Cells 门上创建直方图：
- X = FITC-A（CFSE）或 Pacific Blue-A（CTV），坐标用 Log（对数）
- 注意：这里和细胞周期的 Linear 相反，因为 CFSE 荧光跨越 2⁷ = 128 倍的动态范围，用 Log 才能压缩展示
- X 轴范围 10³–10⁷，把所有峰都包含进来
正常结果的特征：
- T0 对照管是一个高而尖锐的单峰，位于荧光最右端（第 0 代）
- 刺激孔（如加 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞）出现 6–8 个等间距的阶梯峰，每个峰代表一个分裂代数
- 最左边靠近自发荧光的是已经分裂 6+ 代、染料几乎耗尽的细胞
第 4 步：用 FlowJo Proliferation Platform 自动计算
FlowJo 有专门的增殖分析平台，不要手动估峰：
- 选中 CFSE 直方图 → 右键 → Tools → Proliferation Platform
- 弹出增殖分析窗口，设置关键参数：
- Proliferation Type：选 “Cell Trace”（CFSE 类染料）
- Generation Numbering：从右往左，最右 T0 峰为第 0 代（Gen 0），依次左移 1、2、3…
- Estimate Peaks：点击 Auto，FlowJo 会根据等间距规则自动识别峰位
- 如果 Auto 出来峰数不对，可以手动加减峰，或者手动调整每个峰的中心位置
- 点击 Compute，FlowJo 会输出完整的增殖统计量
第 5 步：解读增殖统计量结果
FlowJo / ModFit 输出的几个关键指标（论文里最常用的）：
| 指标 | 英文全称 | 含义 | 典型值 |
|---|---|---|---|
| Proliferation Index（PI / Div. Index） | 分裂指数（增殖指数） | 原始一个细胞经过培养后，平均分裂了几次（考虑未分裂细胞贡献为 0） | 未刺激 1.0，强刺激 3.0–5.0 |
| Division Index（DI） | 分裂指数（更准确版本） | 平均每个起始细胞经历的分裂次数（和 PI 类似，部分软件算法略有差异） | 同上 |
| % Divided（%Parent） | 已分裂细胞占比 | 在起始细胞中，至少发生过 1 次分裂的细胞百分比 | 未刺激 <5%，强刺激 >80% |
| Precursor Frequency | 前体频率 / 响应率 | 等同于 %Divided | 同上 |
| Mean Division Number | 平均分裂代数 | 对所有细胞（含未分裂）计算的平均代数 | 未刺激 0.0，强刺激 2.5–4.0 |
| 各代数比例（% G0, % G1 …） | 各代细胞占比 | 每一世代的细胞数百分比，可以画柱状图 | — |
论文推荐报告 3 个：Proliferation Index（综合体现分裂次数）+ %Divided（体现响应细胞比例）+ 各代柱状图（展示代数分布）。三者互相补充，结果最完整。
常见坑 & 异常处理
异常 1：峰之间不对称、不按倍数关系（峰间距忽宽忽窄）
原因 1：CFSE 染色时加样不均（染料加进去没立刻混匀，细胞群分两次被染色，出现两个”第 0 代”） 解决：染色时染料必须一滴一滴加，边加边快速涡旋混匀
原因 2：采集电压在采集过程中漂移（长时间多管采集时流式激光器预热不完全） 解决：开机后至少预热 30 min 再采集；每 10 管插一次质控微球验证电压稳定性
异常 2：峰严重拖尾，每个峰之间分不开
原因 1：CFSE 浓度过低，第一代和第二代之间信噪比差，峰被噪声淹没 解决：提高染色浓度（1 µM → 2.5 µM）
原因 2：培养时间过长（>5 天），大部分细胞分裂 >7 代，染料耗尽与自发荧光融合 解决：提前至 Day 3–Day 4 取样；或用 CTV（光稳定性更好，能多跟踪 1–2 代）替代 CFSE
原因 3：染色后细胞立即死亡，染料泄漏 解决：检查细胞状态，染色前保证存活率 >90%；染色 37°C 时间不要超过 10 min
异常 3：T0 对照也出现两个峰
原因：染色时细胞已经有两个状态（例如细胞分团，部分细胞团内部没染上染料） 解决：染色前细胞充分吹打成单细胞悬液；过 40 µm 细胞筛过滤再染色
异常 4：阴性对照（未染色）峰的位置和 CFSE 的 Gen 6+ 重叠
原因 1：代数太多，CFSE 完全被稀释耗尽 解决：减少培养时间，或提高初始染色浓度；分析时只取到能明确分辨的代数，最左边混叠的统一归为”Gen 6+“合并统计
原因 2：死细胞的自发荧光干扰 解决：加死活染料（如 Zombie Aqua / DAPI），圈门时去除死细胞，让自发荧光通道干净
异常 5：同一管样品分两次采集，PI 差 0.5 以上
原因：第 3 步圈门，尤其是单细胞门（Single Cells）画得宽窄不一，会严重影响 Proliferation Index（因为粘连细胞被误判为高荧光未分裂细胞） 解决：对所有样品应用完全一致的门（Gate Copy / Paste），不要一管一调。门宽固定后，PI 的复孔 CV 通常 <10%
结果呈现与统计检验
图怎么画
- 直方图叠加图（典型 Figure A）：
- 叠放 Control vs Stimulation vs Drug 的 CFSE 直方图，X = CFSE，Y = 细胞数，在每个峰上方标注 Gen 0/1/2…
- 堆积柱状图（Figure B）：
- X = 分组，Y = 细胞百分比，每柱按 Gen0/Gen1/Gen2/… 分层
- 单一指标柱状图（Figure C）：
- X = 分组，Y = Proliferation Index（或 %Divided），带均值 ± SEM 误差棒
统计检验
| 指标类型 | 两组比较 | 多组比较 |
|---|---|---|
| Proliferation Index / Division Index（连续数值） | 独立样本 t 检验 | One-way ANOVA + Tukey/Dunnett |
| %Divided（百分比类数据） | t 检验（近似正态）or Mann–Whitney | ANOVA 或 Kruskal–Wallis |
| 多时间点追踪（Day 1/3/5） | — | Two-way RM ANOVA |
百分比数据（%Divided、各代比例）严格来看并不完全是正态分布。如果 n≥5 且数值在 20–80% 区间，可以用 t 检验 / ANOVA。若数值在 <10% 或 >90% 的极端区，建议换成非参数检验（Mann–Whitney / Kruskal–Wallis）。
和其他增殖方法对比
| 方法 | 能得到的信息 | 适用场景 |
|---|---|---|
| CFSE / CTV + 流式 | 分裂代数分布、PI、%Divided | 免疫学（T 细胞增殖）、药物抗增殖、不同亚群异质性分析 |
| CCK-8 / MTT | 终点活细胞数量（相对） | 快速高通量 96 孔板筛选 |
| BrdU / EdU + 流式 | 某一时间点 S 期比例 | 周期瞬时快照，结合周期分析更准 |
| Ki67 染色 | 正在增殖的细胞比例（组织切片/流式） | 组织 IHC 判断增殖状态 |
没有谁”更好”，要回答的问题不同。一般建议先用 CCK-8 做初筛（96 孔便宜高通量），再用 CFSE 深层挖掘每代分布信息，两者一致的结果在论文中更有说服力。完整 CCK-8 操作可参考 CCK-8 实验操作与优化指南。