什么是 RT-qPCR：qPCR 术语解释

RT-qPCR 是什么

RT-qPCR（Reverse Transcription quantitative PCR，反转录实时荧光定量 PCR）是将 RNA 反转录为 cDNA，再以 cDNA 为模板做 qPCR 进行实时定量检测的方法。它结合了反转录（RT 步骤）与荧光定量（qPCR 步骤），是测量基因 mRNA 表达水平的金标准。“RT” 容易与 Reverse Transcription 和 Real-Time 混淆，行业惯例是 RT-qPCR 指反转录 + 实时定量，而 RT-PCR 多指反转录 + 普通 PCR。

为什么 RT-qPCR 重要

它能在 pg 级别灵敏、特异地检测 RNA 表达变化，广泛用于基因表达差异分析、病原 RNA 检测（如病毒核酸筛查）、可变剪接研究等。与 Northern blot、RNA-seq 相比，RT-qPCR 灵敏度更高、重现性更好、成本低，是验证 RNA-seq 差异表达结果的标准方法。

常见误区

1. 不分 One-step 与 Two-step：两步法（先 RT 再 qPCR）灵活、可重复检测多个基因；一步法（同一管内完成）灵敏但灵活性差，适合高通量检测。
2. 省略 -RT 对照：不设无反转录酶对照时，基因组 DNA 残留会被当成阳性信号，必须做对照或加 DNase 处理。
3. RNA 质量不过关就开做：降解或 A260/280 不达标的 RNA 会让 Ct 严重漂移。

相关工具

• 引物基础检查：核对单条引物的长度、GC 和简化 Tm，不检查外显子位置。
• PCR 体系计算器：配制 qPCR 反应液。

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