如果曲线本身稳定，再排查模板、引物和体系。
适用场景
遇到以下现象时，建议按下面的排查顺序逐步缩小范围，而不是一次性同时调整多个变量。
- 标准曲线斜率异常
- 扩增效率偏低
- 同批样本 Ct 值整体偏高
01
先看标准曲线本身是否可信
R²、斜率和各浓度点分布是否正常？
标准曲线本身不稳时，先不要直接解读扩增效率。
可能原因
- 梯度稀释不准
- 异常点未识别
- 浓度区间不合适
推荐处理方式
- 重配标准品梯度
- 复查异常点
- 减少极端浓度点
02
检查模板输入和质量
模板量是否过少、是否存在降解或抑制物？
模板质量可信时，继续看引物与体系。
模板降解或抑制物会让效率和重复性同时变差。
可能原因
- 浓度低
- 降解
- 纯度不足
推荐处理方式
- 重新定量模板
- 清理抑制物
- 标准化输入量
03
判断引物设计和退火温度
引物是否存在二聚体、非特异风险，退火温度是否合理？
引物风险低时，再回到体系和操作差异。
引物效率差或退火温度不合适会直接拉低扩增效率。
可能原因
- 引物设计不佳
- Tm 差异大
- 退火温度设置不佳
推荐处理方式
- 复核引物设计
- 优化 Ta
- 必要时更换引物
04
复核主混液和移液一致性
是否统一配置主混液？重复孔差异是否明显？
如果重复孔稳定，效率问题更可能来自模板或引物。
移液误差和混匀不足会让效率和 Ct 一起波动。
可能原因
- 移液误差
- 混匀不足
- 板间差异
推荐处理方式
- 统一主混液
- 短暂离心
- 保持封板和分析参数一致
复制排查清单
勾选已经完成的步骤后，可以复制一份文字版排查记录，用于实验记录或发给同事复核。
排查清单预览