核酸电泳上样操作指南：加样技巧、样品准备与常见上样失败排查

上样为什么值得单独讲

上样是电泳中最容易被当作“熟练动作”忽略的一步。但条带弥散、拖尾、漂移、甚至整条泳道无信号，追溯上去常常是上样环节出了问题——样品体积太大撑爆孔、loading buffer 比例不对导致密度不够样品飘出、枪头刺破孔底让样品漏到胶下面。

本文从样品准备、上样操作、孔形检查三个维度系统梳理，配合常见失败排查。

上样前：样品准备

loading buffer 的作用与选择

loading buffer（上样缓冲液）的核心成分是甘油或蔗糖（增加密度让样品沉入孔底）和指示染料（溴酚蓝、二甲苯青等用于追踪电泳进度）。没有 loading buffer 的样品密度与电泳缓冲液接近，加入孔中会向上扩散飘出。

混合比例：6× loading buffer 与样品按 1:5 混合（如 10 μL 样品 + 2 μL 6× loading buffer），最终为 1× 浓度。比例过高（如加了 1/3 体积）会让甘油粘度过大、加样困难；过低则密度不够，样品可能飘出。

上样量计算

上样量不是“越多越好”。总质量过高会导致条带拖尾、弥散；过低则看不到条带。

体积控制：10-15 μL 比较合适于常规加样孔（约 1 mm 厚 × 5 mm 宽）。体积超过 20 μL 时容易溢出孔口，需用宽孔梳子或减少体积。

样品处理

上样操作：手法与关键点

标准加样步骤

1. 准备：将凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液（TAE 或 TBE），液面刚没过凝胶约 1-2 mm
2. 混合：样品与 6× loading buffer 按 5:1 混合，轻柔吹打均匀
3. 吸样：用细枪头（10 μL 或 200 μL 枪头均可，关键是稳定）吸取样品
4. 定位：枪头对准加样孔中心，垂直于凝胶面，手臂找一个稳定的支撑点
5. 插入：枪头尖轻轻插入孔底，不要用力戳——感到轻微触底即可
6. 加样：缓慢推出样品（约 2-3 秒），让样品沉入孔底
7. 停留：推出后保持 1-2 秒，让样品完全沉降
8. 抬起：垂直抬起枪头，不要左右晃动
9. 静置：所有孔加完后等待 10-30 秒，让样品充分沉降后再通电

关键操作要点

• 枪头不要触壁：触碰孔壁会导致样品挂壁，部分样品粘在胶壁上不进入孔底
• 不要过快：快速推出会产生湍流把样品带出孔外
• 不要刺穿孔底：孔底胶很薄（约 2-3 mm），用力过大直接刺穿后样品漏到缓冲液中
• 加样时手要稳：抖动会导致枪头在孔内晃动，破坏孔形
• 缓冲液液面合适：太多会让样品从顶部飘出；太少则孔口暴露，样品不连续

孔形检查：上样前必须确认

加样前先检查孔是否完整可用，否则操作再标准也没用。

拔梳子技巧：倒胶后等凝胶完全凝固（室温 30-45 min），拔梳子时垂直向上、匀速拔出。快速或倾斜拔会撕裂孔壁。

常见上样失败排查

1. 样品从孔中飘出

现象：加样后看不到蓝色样品沉入孔底，或加样后样品立即消失。

原因：

• loading buffer 比例不对（甘油浓度不够）
• 样品含盐量高，密度大但没有 loading buffer 配合
• 缓冲液液面太高，从顶部冲走
• 枪头没有插入孔底

处理：确认 loading buffer 为 1× 终浓度；降低缓冲液液面至刚没过胶面；加样时枪头尖插入孔底。

2. 加样后样品扩散

现象：加样时看到样品进入孔底，但通电前样品向上扩散。

原因：

• loading buffer 甘油/蔗糖不够
• 样品体积过大稀释了 loading buffer 的密度
• 样品温度高（刚从 65°C 加热后未冷却）

处理：减少样品体积或增加 loading buffer 比例至 1×；加热处理的样品先室温放置 2 min 再加样。

3. 枪头刺穿孔底

现象：加样时感觉没有阻力，样品推出后看不到踪迹。

原因：枪头插入过深，刺穿孔底薄胶层。低浓度胶（<0.8%）尤其脆弱。

处理：换新胶。下次加样时枪头只插入孔深 2/3 处，感到轻微触底感即停止。

4. 条带弯曲微笑带

现象：电泳后条带呈 U 形（两侧向下弯曲）。

上样相关原因：

• 上样体积过大，样品在孔内过厚导致中间受力大
• 样品盐浓度高，中间离子多迁移慢

处理：减少上样体积；脱盐后再上样。

5. 条带拖尾弥散

现象：条带不锐利，向前后拖尾。

上样相关原因：

• 上样量过大（>1 μg DNA/孔）
• 样品未与 loading buffer 充分混匀
• 加样时枪头晃动破坏了样品的层流

处理：减少上样量至 200-500 ng；混匀时轻柔吹打 3-5 次；加样时手稳。

6. 泳道间交叉污染

现象：相邻泳道出现非特异条带或背景。

原因：加样时枪头碰到隔壁孔壁，或加样后样品溢出孔口。

处理：加样时枪头垂直对准孔中心；上样体积不超过孔容量的 80%；加样后等待 30 秒再通电。

上样操作速查

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