先看条带是”宽”还是”脏”
宽而模糊通常与胶浓度、电压和上样量有关；出现拖尾或底部发散，则更常见于样品降解、盐离子过高或缓冲液状态异常。
弥散类型快速分流表：
| 弥散形态 | 位置 | 最可能原因 | 优先排查动作 |
|---|---|---|---|
| 整体条带变宽、不尖锐，整条都是 | 全泳道 | 胶浓度太低 / 上样量过多 | 提高胶浓度 +2%，减少 30-50% 上样量重跑 |
| 泳道底部（<1 kb）拖尾成”彗星”状 | 胶下端 | 核酸降解（DNase 或反复冻融） | 同一样品新鲜提取后再跑 |
| 泳道上方（>5 kb）拖尾，大片段跑不下来 | 胶上端 | 样品里有蛋白/多糖/杂质结合 DNA | 酚氯仿再抽提 + RNase/蛋白酶 K 处理 |
| 所有泳道都有弥散、Marker 也弥散 | 整张胶 | 缓冲液旧了 / 电压过高 / 胶聚合不好 | 换新配 1× TAE/TBE，降低电压 20%，新配胶 |
| 只有样品泳道弥散、Marker 清晰 | 样品泳道 | 样品本身问题（降解/盐过高/蛋白残留） | 参看样品质量排查 |
| 条带出现”阶梯式”拖尾 | 间隔 ~200 bp | 真核样品 rRNA 或质粒 multimer | 正常现象，关注目标带即可 |
最有效的回看顺序
上样量、胶浓度、缓冲液新鲜程度、电压条件这四项，通常能解释大部分条带弥散问题。
1. 样品质量问题（40% 的弥散原因）
核酸降解的典型特征：
- 基因组 DNA 样品：上样孔附近没有一个亮带，而是整片都亮，呈”涂抹状”从孔里一直延伸下来
- RNA 样品：28S/18S（或 23S/16S）条带模糊，5S 区域非常亮
- 质粒：超螺旋带变成拖尾，没有明确的 3 条（超螺旋/开环/线性）区分，而是连成一片
- 降解越严重，弥散越偏向小分子量区域（胶下方更亮）
降解的原因及修复：
| 原因 | 常见场景 | 修复 |
|---|---|---|
| 反复冻融 | 样品 -20°C 放了 >3 个月、或一天内取用 >3 次 | 分装 20 μL/管，-80°C 保存，用完即弃 |
| 内源性 DNase/RNase 没灭活 | 提取最后一步 70% 乙醇洗后没充分晾干就加水溶解 | 重新提取，加入 0.1% DEPC 水或 RNase-free 水 |
| 枪头/离心管带核酸酶 | 用了非无菌无酶的便宜耗材 | 换无酶级枪头 + 离心管，操作台擦 RNaseZap |
| 金属离子激活降解 | 提取产物里残留 Mg²⁺ 等二价阳离子 | 加 EDTA 至终浓度 0.1 mM，或过一次 PCR Cleanup 柱 |
样品盐浓度/杂质过高：
- 高盐的特征：条带整体”压不下去”，目标带位置偏高，且上样孔残留一圈亮带
- 判断方法：测 A230，A230/A280 > 0.8 说明盐/有机溶剂残留
- 修复：过 PCR Cleanup 柱或乙醇再沉淀一次（0.3 M NaAc + 2.5 倍体积无水乙醇，-20°C 30 min）
2. 胶浓度选择不当（20% 的弥散原因）
根据目标片段大小选胶浓度的经验表：
| 目标片段大小 | 推荐琼脂糖浓度 | 电压 | 备注 |
|---|---|---|---|
| < 200 bp | 2.0 ~ 2.5% | 80-100 V | 可以用 NuSieve 低熔点胶提高分辨率 |
| 200 ~ 1,000 bp | 1.5 ~ 2.0% | 80-100 V | 普通 Marker 最清晰区域 |
| 1,000 ~ 6,000 bp | 0.8 ~ 1.2% | 80-120 V | 基因组和质粒常规胶 |
| 6,000 ~ 20,000 bp | 0.5 ~ 0.8% | 60-80 V | 降低电压、跑久一点，防止大片段拖尾 |
| > 20 kb 基因组 DNA | 0.3 ~ 0.5% 脉冲场 | 低电压脉冲 | 普通胶会严重拖尾成一条线，必须脉冲场 |
选错胶浓度的典型错误：
- 20 kb 基因组跑 1% 胶 → 永远是拖尾，根本不会出清晰带
- 100 bp 小片段跑 0.8% 胶 → 带跑到胶底部扩散，根本看不到
3. 上样与电泳条件问题（20% 的弥散原因）
上样量过多：
- 上样量超过孔容量 80% 时，样品会溢出到相邻泳道，形成”带拖到隔壁”的假象
- 每条泳道推荐上样量：PCR 产物 5-20 μL（<1 μg 总 DNA）；质粒 0.5-2 μg；基因组 <5 μg
- 过载的典型：上样孔发亮、整个泳道都亮、目标带是一大片而不是一条线
Loading Buffer 的问题：
- Loading Buffer 配了太久（>1 个月）：溴酚蓝降解，甘油吸潮，指示染料跑歪
- 6× Loading Buffer 比例不对：应是样品 : Loading Buffer = 5:1
- 正确做法：Loading Buffer 分装 -20°C 小份存放，每支只用 2-3 次
电压/时间：
- 电压过高（>150 V）且胶 >10 cm：胶发热 → 条带弥散（泳道中央比两边跑得快，呈”笑脸”，所有带都变宽）
- 经验：胶长（cm）× 8-12 V，比如 10 cm 胶跑 80-120 V
- 溴酚蓝跑到胶 2/3 处就停止，不要跑到底（小片段跑丢了）
胶聚合问题：
- 琼脂糖没有完全溶解：微波炉加热后还有小颗粒 → 冷却制胶后局部浓度不均，形成”波浪状”条带
- 加 EB/GelRed/GelGreen 的时机不对：60°C 以上加染料会降解，条带荧光不均
- 正确：煮沸溶解后，冷却至 55-60°C 手感温热不烫手再加染料，混匀后立即倒胶
4. 缓冲液问题（10% 的弥散原因）
TAE vs TBE 选择：
- TAE：分辨率好（大片段比 TBE 清楚），电泳快，但缓冲容量低，2-3 次就必须换
- TBE：缓冲容量大（跑 5 次没问题），但分辨率略差，且硼酸会抑制某些酶切，后续胶回收不能用 TBE
缓冲液失效的信号：
- 1× 工作液跑了 >3 次；或者 50× 原液用了 >6 个月
- 电泳 30 min 后摸胶板：发热发烫（>40°C）
- 所有泳道 + Marker 全都是弥散的（这是缓冲液失效最典型的信号！）
紧急修复：立即停跑 → 重新配置 1× TAE（50× 原液 : 去离子水 = 1:49）→ 换新胶重跑
5. 核酸类型特异问题
基因组 DNA 拖尾：
- 原因 1：提取时吹打太猛、反复过细枪头 → 机械剪切（高分子量 DNA 最容易被剪断）
- 原因 2：样本来源是 FFPE 石蜡切片 → 天然交联和降解（弥散是正常的，一般不影响 PCR）
- 解决：用宽口枪头转移、减少涡旋；FFPE 样品解交联时间加长
质粒拖尾：
- 质粒正常应该是 3 条带（超螺旋 > 线性 > 开环，跑在最前面是超螺旋）
- 如果超螺旋带变成拖尾 → 提取时碱裂解时间太长（>5 min），基因组 DNA 降解成小片段混入质粒
- 如果 3 条带都弥散 → 加乙醇沉淀时涡旋了，机械剪切质粒
RNA 弥散：
- RNA 天然比 DNA 更容易降解，一般看 28S:18S 条带亮度比（>1.5:1 才合格）
- RNA 胶要用 MOPS buffer + 甲醛变性胶，普通 TAE 胶跑 RNA 一定会有轻微弥散（二级结构未打开）
应急快速修复流程（15 分钟就能验证）
- 减少 50% 上样量 + 新鲜胶重跑：最简单粗暴的一步；如果过载导致的，这一步 50% 的情况就好了
- 重新配制 1× TAE 缓冲液 + 新胶：如果 Marker 也弥散 → 缓冲液的锅，这一步 90% 能解决
- 样品再纯化一轮：过 PCR Cleanup 或乙醇沉淀；如果修复后条带变清晰 → 样品的锅
- 提高胶浓度 2%（比如原来 1% → 改成 1.2% 或 1.5%）：小片段弥散的常用手段
- 降低电压 + 延长跑胶时间（比如 120 V 降 80 V，时间加长 30%）：大片段弥散的常用手段
如果以上 5 步都没用 → 基本可以判定是样品本身降解了，重新提取再做吧。
相关工具
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本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。