核酸电泳无条带：先排 PCR 还是先排跑胶？

先判断扩增端还是检测端

如果 PCR 阳性对照有产物，但电泳看不到条带，通常优先怀疑跑胶和检测环节；若对照和样本都没有条带，再回到扩增本身。

用 3 组对照快速分流：

如果 PCR 管里可以看到明显的白色沉淀（引物二聚体）但电泳无带 → 十有八九是电泳端问题。

跑胶端常见原因

缓冲液配错、染料失效、胶浓度不合适、样品上样量过少、跑胶电压过高或时间过短，都会让条带难以辨认。

1. 上样与样品问题

上样量不足（最常见的”无带”原因）：

• PCR 产物（50 μL 体系）建议上样 5-10 μL + 1-2 μL 6× loading buffer
• 如果做的是 qPCR 产物（20 μL 体系）且 Ct > 30，要上 10 μL+，不要只上 2 μL
• 产物浓度估计：qPCR Ct 25 约对应 10⁸ copies/μL，Ct 30 约 10⁶，Ct 35 约 10⁴；低于 10⁴ copies/μL 的产物常规 EB/GL 染色难以看到
• 解决：低浓度样本用 2% 琼脂糖、增加上样体积到 15-20 μL、或浓缩（乙醇沉淀后重悬在 5 μL）

样品降解 / 酶切失活：

• 核酸酶污染：PCR 产物 4°C 放了 1 周 + 没加 EDTA → 被残留 DNase 降解
• 反复冻融：长片段 DNA（>3 kb）冻融 3 次会断成小片段，条带变弱甚至消失
• Loading buffer 含 SDS 太多：SDS 会让 EB/核酸染料沉淀，条带位置呈现白色”负带”或完全看不到

2. 胶与缓冲液问题

琼脂糖浓度选择参考：

3. 染料与成像问题

染料失效或浓度不够：

• EB（溴化乙锭）：10 mg/mL 母液，终浓度 0.5 μg/mL，避光保存，见光降解
• GoldView / SYBR Green / GelRed：同样需要避光，且不能加在 65°C 以上的胶里（高温降解染料）
• 染料浓度过低：EB 只加了平时的 1/10，灵敏度差 5-10 倍
• 错误：染料加在了 loading buffer 里，而不是胶里 → 只有 loading buffer 位置有荧光，产物位置看不到

成像参数错：

• 紫外成像仪用了白光模式而不是 254/302 nm UV → 看不到 EB/SYBR
• 成像时没放滤光片（EB 要橙色滤光片，SYBR Green 要黄色滤光片）→ 一片白板
• 手机拍照没开夜间模式 + 关灯 → 曝光不够，弱带拍不出来

4. 跑胶参数问题

• 电压过高：5 V/cm 是标准值；>10 V/cm 会过热导致 DNA 降解，条带变弱或消失
• 时间过短：溴酚蓝只跑到胶一半就停了 → 小片段还没和染料分开，和 loading buffer 混在一起看不到
• 时间过长：溴酚蓝跑出胶外 → 小片段（<100 bp）可能一起跑出去，无带
• 上样时漏样：枪头没插入孔内、插在孔壁外侧，样品飘出孔 → 孔里没东西自然没带

PCR 扩增端失败时的交叉验证

如果确认是扩增失败（Marker OK、阳性对照 OK 但样本无带）：

1. 用原 PCR 管再跑一次：确认不是”上样漏了”的假阴性
2. 2× 模板再做 PCR：排除模板浓度太低
3. 换内参引物扩增：如 GAPDH/Actin/16S rRNA，如果内参也没带→模板本身降解或提取失败
4. 做 1:10 稀释模板：如果稀释后反而出带 = 模板里有抑制物

最低成本的快速排查流程（10 分钟定方向）

1. 拿同一批 PCR 产物，用另一个实验室的胶/仪器/染料跑一次：两个实验室都没带 = PCR 端失败；另一个 OK = 自己的跑胶端出了问题
2. 用 DNA Marker 点 3 个孔：1 μL、3 μL、5 μL，1 μL 都有清晰带 → 胶/染料系统没问题；5 μL 都没带 = 系统彻底挂
3. 加样孔里留 1 μL 产物直接加 1 μL 10 mg/mL EB 再紫外看：孔里有荧光 = 产物确实存在，是跑胶没跑出来；孔里也没荧光=扩增完全没产物

延伸阅读：Marker 正常但样本无带的特殊情况、PCR 无条带的扩增端排查、Marker 弥散模糊的修复。