qPCR 数据质控与异常值处理：从复孔差异到 Ct 可信度判断

先确认数据能回答什么问题

本文用于科研 qPCR 数据检查。先检查原始曲线、对照、检测范围和重复性，再计算表达量；不能把 Ct 35、38 或固定的复孔差作为所有体系的合格线。具体判定规则应在分析前根据检测体系验证结果确定。

原始数据检查清单

复孔差异与异常值

同一样本的技术重复先按孔检查，再汇总到生物学样本。复孔允许的变异应来自本体系在相应输入范围内的重复性验证；低拷贝时有信号与无信号交替出现，不能直接归因为移液错误。

Ct 是对数尺度，不把 SD(Ct)/平均Ct 的 CV 当作通用删孔标准，也不把它等同于拷贝数或表达量的 CV。保留原始逐孔结果，可报告 Ct 的 SD；定量精密度则在所用定量模型得到的数量尺度上评估，并说明计算方法。

遇到偏离孔，依次查看气泡、封板、加样、曲线和产物特异性。仅按事先规定且有依据的规则排除，并保存原因；原因不明时保留、标记，必要时复测。统计异常值标记或“不符合预期生物学方向”都不是单独删点的理由。不能把未检出孔直接赋值为最后一个循环，再参与平均。

先区分检出与可定量

LOD 描述检测能力，LOQ 描述满足预定定量精密度等要求的能力，两者需分别验证。低浓度重复实验用于估计检出率和定量变异，不能用“比 NTC 早3个循环”替代；NTC 未检出时也不存在一个可直接相减的 Ct。检出但低于已验证 LOQ 的样本，不报告超出能力范围的精确表达倍数。

内参和归一化

候选内参须覆盖实际组织、处理与时间条件进行验证。同组 Ct 接近或多个基因同向变化，不足以独立证明内参稳定；也不能因某基因方向不同就立即删除。参考内参选择与稳定性评估。

多内参归一化通常使用经效率校正的相对数量的几何平均。下面的简化计算仅适用于目标和参考检测效率满足该模型假设、样本处于定量范围且内参已验证的情况：

ΔCt = Ct(目的基因) - Ct(参考基因)
ΔΔCt = ΔCt(样本) - ΔCt(校准样本)
相对表达倍数 = 2^(-ΔΔCt)

例如 ΔΔCt = -3，在每循环理想翻倍的假设下对应 8 倍；这只是算例。效率不符合假设时应选择相应效率校正模型，不能凭效率落入一个宽泛区间就认为可直接使用 2^-ΔΔCt。

先检查同一生物学样本的技术复孔，再计算该样本的归一化结果；统计样本数以独立生物学重复计。相同权重和相同孔集合下，“均值之差”与“差值的均值”可相等，不能笼统声称先平均 Ct 必然引入偏差；缺失孔、不同权重和非线性变换必须明确处理方式。

报告表格示例

下面保留一个理想效率下的计算示例，表内数值不是可接受 Ct 范围，也不代表真实实验验证。实际报告还应提供各生物学样本结果、技术复孔和不确定性。

不能把技术孔数当作生物学样本数，也不能只报告倍数变化而省略模型、重复数与误差。

标准曲线与报告

检查斜率、效率、残差、重复性、线性范围与低浓度检出情况。R² 高不保证曲线各浓度都可用，也不能为了提高 R² 随意删除末点。见扩增效率排查。

报告至少包括检测方法、引物/探针、输入量、逐孔 Ct 与未检出记录、对照、效率及定量范围、内参验证、排除和复测规则、归一化模型与生物学重复数。保留原始数据，使读者能区分技术不确定性和生物学差异。

参考资料与适用范围

• MIQE précis（Bustin 等，2010）：对照、内参验证与透明报告。
• Forootan 等：qPCR 检出限与定量限的实验确定（2017）：LOD、LOQ 与低浓度重复实验。
• Bio-Rad：Reagent Comparison Guide for Real-Time PCR：效率、线性范围及分析方法比较。
• MIQE 2.0（2025）：效率校正数量、检测限与动态范围。
• MIQE 原文（2009），检测限与精密度部分：不以任意 Cq 界限替代验证，区分 Ct 与数量尺度的变异。