核酸提取纯度不合格：A260/280 异常的判断与处理

问题表现

NanoDrop 或分光光度计测定核酸样品时，A260/280 比值超出正常范围：

• DNA 正常范围：1.8-2.0
• RNA 正常范围：1.9-2.1

偏离此范围的常见情况：

原因一：A260/280 偏低 — 蛋白质残留

成因

蛋白质在 280 nm 处有强吸收峰（芳香族氨基酸），核酸在 260 nm 处吸收最强。当蛋白质与核酸共提取或分离不彻底时，280 nm 吸收增加，导致比值下降。

常见来源

• 裂解不充分：蛋白酶 K 消化时间不够或温度过低
• 酚-氯仿抽提时取水相误吸了中间蛋白层
• 硅胶柱洗涤不彻底，蛋白结合在膜上
• 样本本身蛋白含量高（血液、肝脏等）

诊断方法

1. NanoDrop 图形：280 nm 处有明显肩峰，基线不平滑
2. 定量偏差：测得浓度偏高（蛋白贡献了部分吸收）
3. 下游验证：PCR 扩增效率下降或完全被抑制

处理方案

方案 A：酚-氯仿再抽提（效果最好）

1. 向核酸溶液中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）
2. 充分混匀，12000×g 离心 5 min
3. 小心吸取上层水相至新管
4. 加入 1/10 体积 3M 醋酸钠 + 2.5 倍体积无水乙醇沉淀
5. 70% 乙醇洗涤 2 次，晾干后重新溶解

方案 B：硅胶柱纯化（操作简单）

1. 将核酸溶液与结合缓冲液混合后上柱
2. 按试剂盒说明洗涤 2-3 次
3. 洗脱后重新测定

方案 C：蛋白酶 K 再消化（适合大量蛋白残留）

1. 加入蛋白酶 K 至终浓度 100-200 μg/mL
2. 50°C 孵育 30-60 min
3. 酚-氯仿抽提或硅胶柱纯化

预防

• 裂解时确保蛋白酶 K 终浓度 ≥ 100 μg/mL
• 裂解温度 50-55°C，时间 ≥ 30 min
• 酚-氯仿抽提吸取水相时留 2-3 mm 安全层
• 硅胶柱法确保洗涤缓冲液含离液盐（如盐酸胍）

原因二：A260/280 偏低 — 酚残留

成因

酚在 270 nm 附近有强吸收峰，与 280 nm 部分重叠，会使 A260/280 比值假性降低。酚残留多见于酚-氯仿法提取后水相分离不彻底。

诊断

• 视觉：产物呈粉红色或微红色
• 吸光度：A260/A270 < 1.0（正常应 > 1.5）
• 嗅觉：有酚味

处理方案

1. 氯仿再抽提：加入等体积氯仿:异戊醇（24:1），混匀离心，取上清
2. 乙醇再沉淀：醋酸钠 + 无水乙醇沉淀，70% 乙醇洗涤 2 次
3. 充分干燥确保无酚味后重新溶解

详细的酚残留处理可参考 提取产物颜色异常排查。

原因三：A260/280 偏高 — RNA 污染（DNA 样品）

成因

RNA 的 A260/280 比值通常在 2.0-2.1，如果 DNA 样品中混入 RNA，会使整体比值升高。常见于：

• 提取 DNA 时未加入 RNase A
• RNase A 失活或浓度不够
• 样本本身 RNA 含量极高（如肝脏、酵母对数生长期）

诊断

• 比值：A260/280 > 2.0（DNA 样品）
• 电泳验证：凝胶底部出现大量弥散（RNA 大分子被降解为小片段）
• 定量偏差：测得 DNA 浓度偏高（RNA 贡献了 260 nm 吸收）

处理方案

1. RNase A 处理：加入 RNase A 至终浓度 10-20 μg/mL，37°C 孵育 30 min
2. 纯化去除：酚-氯仿抽提或硅胶柱纯化去除降解的 RNA 片段
3. 重新测定：处理后重新测 A260/280 应回到 1.8-2.0

预防

• DNA 提取时必须在裂解后加入 RNase A（终浓度 ≥ 10 μg/mL）
• RNase A 需 -20°C 保存，避免反复冻融
• 选择含 RNase A 的 DNA 提取试剂盒

原因四：A260/280 偏高 — RNA 降解

成因

RNA 降解后产生的小片段核苷酸在 260 nm 处的吸收效率高于完整 RNA，导致 A260/280 比值假性升高。常见于：

• 提取过程中 RNase 污染（操作未戴手套、器皿未 DEPC 处理）
• 样本保存不当（反复冻融、室温放置过久）
• 提取试剂中 RNase 抑制剂失效

诊断

• 比值：A260/280 > 2.2
• 电泳验证：RNA 电泳 28S/18S 条带模糊或消失，底部弥散严重
• BioAnalyzer：RIN 值 < 5

处理方案

RNA 降解不可逆，无法通过纯化恢复完整性，需要：

1. 重新取样提取，严格控制 RNase 污染
2. 使用 RNase-free 的耗材和试剂
3. 操作全程在冰上进行，戴手套并经常更换
4. 提取后立即分装保存于 -80°C

详细的 RNA 完整性评估方法可参考 RNA 完整性评估。

原因五：pH 值影响比值

成因

A260/280 比值对 pH 高度敏感。碱性条件（pH > 8.0）会使 280 nm 吸收降低，导致比值升高；酸性条件则相反。

诊断

• 同一样品用水溶解测 A260/280 = 1.7，换 TE（pH 8.0）后变 1.9
• 这是正常现象，不代表纯度有变化

处理方案

• 统一使用 TE 缓冲液（pH 8.0）溶解核酸，保证测定条件一致
• 对比不同批次样品时确保溶解液 pH 相同
• NanoDrop 校准时使用与溶解液相同的缓冲液作为空白对照

A260/280 与 A260/230 联合判断

纯度评估需结合 A260/230 比值（正常 1.8-2.2）综合判断：

详细的 A260/230 异常处理可参考 DNA 提取 A260/230 偏低排查。

不同提取方法的常见纯度问题

排查顺序

1. 先确认 pH：确保溶解液和空白对照一致（TE pH 8.0 为佳）
2. 看比值方向：偏低→蛋白/酚，偏高→RNA/降解
3. 看 A260/230：联合判断是否有盐/多糖污染
4. 看 NanoDrop 图形：280 nm 肩峰→蛋白，270 nm 峰→酚，230 nm 肩峰→盐/多糖
5. 电泳验证：底部弥散→RNA 污染或降解
6. 对症纯化：根据污染物选择对应方案
7. 重新提取：纯化后仍不达标，建议换方法重新提取

预防措施

• DNA 提取必须加 RNase A，RNA 提取必须防 RNase 污染
• 酚-氯仿法分相操作保守，宁少勿多
• 硅胶柱法洗涤后充分空离心，确保无洗涤液残留
• 统一使用 TE（pH 8.0）溶解核酸，避免 pH 影响比值
• 每批提取同步运行阴性对照和阳性对照
• 提取后立即测吸光度，异常当天处理效果最好
• 重要样本分装保存，避免反复冻融导致降解