你到底需不需要纯化
很多时候同学们一看到 NanoDrop 比值不对就直接重做实验，其实大可不必。先用以下规则判断：
需要纯化 / 脱盐的情形：
- A260/230 < 1.5，且下游是 qPCR / 酶切 / 建库 / 转染
- 100% 乙腈洗脱的 HPLC 片段，或 6 M 盐酸胍裂解后粗产物
- 样品含盐 >300 mM NaCl 或含 EDTA >10 mM（会抑制大多数酶）
- 加样做 PCR 出现：Ct 比预期延后 3+ 循环 / 有拖尾 / 无条带，且对照正常
暂时不用纯化、改条件即可：
- A260/230 在 1.5–1.8 之间，下游只是普通 PCR：模板量 ×1.5 或 1:5 稀释
- 比值正常但浓度过高：直接稀释
- 只有微量杂质但下游是质粒转染：建议仍然纯化（因为转染对盐非常敏感）
五种主流纯化方法对比
| 方法 | 原理 | 适合片段大小 | 典型回收率 | 适合去除的杂质 | 操作时间 |
|---|---|---|---|---|---|
| 乙醇/异丙醇沉淀 | 高盐 + 醇使核酸析出 | >50 bp | 60–85% | 小分子盐、胍、EDTA | 30–45 分钟 |
| 硅胶柱回收 | 高盐下 DNA 吸附硅胶、低盐洗脱 | 100 bp–10 kbp（普通柱） | 50–75% | 蛋白、盐、引物、dNTP | 15–25 分钟 |
| 酚/氯仿抽提 | 蛋白变性进入有机相 | 全片段 | 75–90% | 大量蛋白、酚溶性杂质 | 20–30 分钟 |
| 透析 / 超滤 | 半透膜扩散过滤 | 按 MWCO | 80–95% | 盐、小分子、染料 | 1–4 小时 |
| 磁珠纯化（AMpure/SPRI） | 聚乙二醇 + 羧基磁珠 | 可调（按 PEG%） | 70–90% | 引物/二聚体、盐、游离核苷酸 | 25–40 分钟 |
各方法操作要点与常见坑
1. 乙醇沉淀（最便宜、最通用）
标准配方：
- 加入 1/10 体积的 3 M NaAc（pH 5.2） 或 1/2 体积的 5 M NH₄Ac
- 加入 2.5 体积预冷无水乙醇（RNA 用 3 体积，防止小 RNA 漏）
- -20°C 放置 30 分钟（质粒/大片段可 -80°C 15 分钟加速）
- 12 000 g 4°C 离心 15 分钟，小心去上清，不要倒吸沉淀
- 70% 冷乙醇洗涤 1–2 次；第 2 次洗后瞬时离心吸尽残留
- 开盖晾干 5–10 分钟（看到沉淀由白转透明即可，不要完全干透）
- 用 TE 或 ddH₂O 溶解
提高回收率的诀窍：
- DNA < 100 bp 或 < 50 ng 总量时加 1 µL GlycoBlue 或 20 µg 糖原共沉淀
- 异丙醇沉淀（0.6–0.7× 体积）比乙醇更能留住小片段，但盐残留更多，洗涤要更彻底
- 上清一定别丢，保留至验证回收成功再倒掉
2. 硅胶柱回收（最适合 PCR 产物 / 酶切产物）
适用于 DNA 片段纯化、酶切后去酶去盐、PCR 纯化。小片段（<100 bp）普通柱不回收，可用 Zymo 小片段专用柱。
操作要点：
- 结合液必须加够（样品 5× 体积的 PB 或 Binding Buffer）
- 加乙醇到洗涤液（很多人忘了这一步，回收率只有 10%）
- 空甩 2 分钟非常关键（去除乙醇残留，否则 A260/230 又会掉）
- 洗脱前 50°C 预热洗脱液、滴到膜中央、静置 2 分钟再离心，回收率提升 15–20%
3. 酚氯仿抽提（去蛋白最强，但有毒）
仅限蛋白多、污染严重的样品，如动物组织手工抽提物、细菌裂解液。
操作要点：
- 等体积 Tris 饱和酚（pH 8.0，DNA）/ 酸性酚（pH 4.5，RNA） 混匀
- 再加入 1/2 体积氯仿：异戊醇（24:1）
- 12 000 g 4°C 离心 5 分钟，取上层水相（<70% 体积，宁可少取不要吸到中层）
- 再做一步纯氯仿抽提去酚（酚残留对 260/280 影响很大）
- 后续接乙醇沉淀
安全： 酚有腐蚀性，戴手套，在通风橱操作。
4. 透析 / 超滤（脱盐最彻底，回收率最高）
适合对盐极其敏感的下游：电转染、显微注射、二代建库、脉冲场电泳前大片段 DNA 处理。
常用规格：
- 小型样品：Millipore Amicon Ultra 0.5 mL（100 kD / 30 kD / 10 kD MWCO）
- 大量样品：Slide-A-Lyzer 透析卡（2 kD / 10 kD / 20 kD）
- 原则：选择 MWCO < 目标分子量的 1/3
操作要点：
- Amicon：先加样品，再补 TE 至满，3 500 g 离心反复 3 次
- 透析卡：悬浮在大体积（100×）透析液中，搅拌，4°C 过夜，中途换液 2 次
- 透析是仅有的能完全去除胍盐而不损失大片段的方法，推荐严重胍盐残留时使用
5. 磁珠纯化（高通量、片段选择首选）
常用于 NGS 建库、PCR 产物片段筛选（去除引物二聚体）。通过调整 PEG% 与磁珠比例来选择保留/丢弃的片段。
通用经验（AMpure XP 类似体系）：
- 0.4× 磁珠比 → 保留 >500 bp 片段，丢弃引物、二聚体、小游离片段
- 0.6× 磁珠比 → 保留 >300 bp 片段
- 1.0× 磁珠比 → 保留 >100 bp（普通 PCR 纯化）
- 1.8× 磁珠比 → 保留 >50 bp（小 RNA 或小片段回收）
关键点：
- 磁珠必须室温平衡 30 分钟再用，低温会严重降低回收率
- 结合时间 ≥ 5 分钟，80% 乙醇洗涤 2 次且乙醇必须覆盖磁珠
- 不要过干（磁珠开裂会导致回收率骤降），看到磁珠边缘出现”光裂纹”立即加洗脱液
四类下游的推荐方案
| 下游 | 推荐纯化方法 | 不推荐 | 理由 |
|---|---|---|---|
| 普通 PCR 产物测序 | 硅胶柱纯化（ExoSAP-IT 酶切更简单） | 酚氯仿 | 不需要去蛋白强度，省时 |
| qPCR 模板（样品不纯 Ct 差） | 乙醇沉淀 + 1:5 稀释或透析 | 直接进样 | 胍盐残留是 qPCR 最大杀手 |
| 酶切/连接/克隆 | 硅胶柱回收；大片段选透析 | 磁珠 0.4× | 连接对盐浓度要求高 |
| 质粒瞬时转染/稳转 | 硅胶大提柱 + 内毒素去除柱；或 CsCl 离心 | 乙醇沉淀 | 内毒素和盐都会导致细胞死/转染效率低 |
| FFPE/植物 gDNA 建库 | 酚氯仿 + 乙醇沉淀 + 磁珠 0.4× 分段 | 单独硅胶柱 | 样品杂质多，多重处理才能去干净 |
| RNA 做 qPCR/RNA-seq | DNase I 处理 + 柱回收 / 磁珠 1.8× | 酚氯仿单独使用 | RNA 样品需同时去 gDNA 与盐 |
纯化后的必做验证
不要纯化完就直接往下游放，至少做下面 1–2 项：
- NanoDrop 复测：看 A260/280、A260/230 是否进入可接受范围
- 1.5–2% 琼脂糖电泳：看是否主带清晰、有无降解或弥散
- qPCR 抑制验证：同一阳性稀释 1:2 与 1:10，如果 Ct 差值不是 2–2.3，说明仍有抑制物残留（需要再次纯化）
- 浓度复核（Qubit 或 Picogreen 更好）：NanoDrop 会高估不纯样品浓度，Qubit 测荧光更能反映真实可扩增的核酸量
常见坑点避坑
- 纯化后浓度不够：不是纯化失败，是初始浓度就低。加共沉淀剂（糖原/GlycoBlue）可提升 30%
- 乙醇沉淀后看不见沉淀：不一定是没了。直接加 TE 溶解，测一下浓度
- 硅胶柱膜破了：离心力太大或样品有颗粒。降低转速，样品 0.45 µm 过滤后上柱
- 磁珠不回收：PEG 浓度不对 / 温度过低 / 乙醇过干。按说明书一步步重配
- 纯化后反而降解：操作中引入 RNase/DNase，或纯水不合格。全程戴手套，工作台 RNAseZap 处理
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本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。