为什么单一比值不够
很多同学只看 A260/280 一个数，就下结论”纯”或”不纯”。实际上 NanoDrop 给出的是一组光谱特征：A260/280 反映蛋白/酚，A260/230 反映盐/胍/醇/多糖，两者互相独立，必须结合判读。
正常范围对照表
| 样品类型 | A260/280 理想 | A260/280 可接受 | A260/230 理想 | A260/230 可接受 |
|---|---|---|---|---|
| 质粒 DNA（中提） | 1.8–1.9 | 1.7–2.0 | >2.2 | >1.8 |
| 基因组 DNA | 1.8 | 1.7–1.95 | >2.1 | >1.8 |
| PCR 产物（胶回收） | 1.8 | 1.7–2.0 | >2.0 | >1.6 |
| 总 RNA | 2.0–2.1 | 1.9–2.2 | >2.2 | >1.8 |
| mRNA | 2.0–2.1 | 1.9–2.2 | >2.2 | >1.8 |
| 寡核苷酸引物 | 约 1.8 | 1.6–1.9 | 不常用 | 不常用 |
判断原则：A260/280 不在可接受区间 → 先处理蛋白/酚；A260/230 不合格 → 先处理盐/胍；两者都差 → 重新抽提或过柱。
四类异常场景的系统判读
1. 仅 A260/280 偏低（< 可接受下限），A260/230 正常
这种情况最常见，说明样品中只残留蛋白或酚，胍盐/醇洗得比较干净。
可能原因：
- 酚氯仿抽提时吸出了蛋白层
- 柱式提取没有用蛋白酶 K 消化或消化时间不足
- 组织样本起始量大、裂解不充分，蛋白共洗脱
下游影响：
- PCR/qPCR：轻微（≤1.65）一般可耐受；<1.5 会抑制 Taq，Ct 延后
- 酶切：影响较大，内切酶易被蛋白竞争抑制
- 转染：影响最大，蛋白会中和脂质体/PEI 电荷，转染效率暴跌
- 建库：<1.7 一般不建议直接建库
处理方案：
- 酚氯仿再抽提 1 次，注意只吸取上层水相（<70% 体积）
- 或添加 1/10 体积 3 M NaAc + 2.5× 无水乙醇重沉淀，70% 乙醇再洗 2 次
- 或过一次硅胶柱回收（低吸附柱对大片段更友好）
2. 仅 A260/230 偏低，A260/280 正常
这是盐/胍/醇残留场景，是 PCR 抑制的头号元凶。今日榜首文章 dna-extraction-260-230-low 已详细展开，这里给决策树：
| A260/230 | 典型污染物 | 紧急处理（最快 30 分钟） | 彻底处理 |
|---|---|---|---|
| 1.5–1.8 | 少量盐/乙醇 | 直接加模板量 ×1.5 做 PCR，通常可行 | 乙醇再沉淀 |
| 1.0–1.5 | 胍盐/多糖明显 | 不建议直接 PCR；先稀释 1:5 测抑制是否减轻 | 透析 / 过柱 |
| <1.0 | 严重胍盐或酚残留 | 不建议任何下游 | 重新抽提 |
下游接受阈值：
- 普通 PCR：A260/230 ≥ 1.3 + 1:5 稀释可进样时可接受
- qPCR：≥ 1.5
- 酶切/连接：≥ 1.8
- NGS 建库：≥ 2.0，低于则必须重纯化
3. A260/280 与 A260/230 同时偏低
这是最糟糕的场景，说明裂解残留 + 洗涤都不到位，常见于：
- 新手上路：裂解加多、洗涤省略或乙醇晾干不彻底
- 复杂样本：植物（多糖多酚）、真菌、FFPE
- 过期试剂盒：结合液失效，DNA 共吸附杂质
处理建议：
- 不要在原样品上”修补”，直接重新取样本重新抽提
- 裂解后增加一步氯仿抽提（不用加酚，仅氯仿即可去蛋白）
- 洗涤时使用含乙醇的洗柱液洗涤 2 次，第 2 次改为 10 000 g 空甩 2 分钟去乙醇
- 植物/真菌样本建议加 PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮）或 PVP-40 去多酚
4. A260/280 偏高（DNA > 2.0、RNA > 2.2）
“越纯越好”是误解。过高比值通常提示：
- RNA 污染（DNA 样品 260/280 > 2.0）：RNA 也在 260 nm 有吸收，260/280 本就 2.0+，DNA 样品若混有 RNA 比值会升高
- DNA 部分降解为寡核苷酸：碎片碱基比更高，260/280 接近 2.0
- 洗脱液 pH 偏差：超纯水 pH 偏低会使 260/280 读数偏高 0.1–0.2
处理：
- RNA 污染：加 RNase A（10 µg/mL）37°C 30 min，再柱回收
- DNA 降解：评估是否影响下游（PCR 片段短可耐受；长片段克隆/建库需重新抽提）
- pH 偏差：改为 TE（10 mM Tris·Cl pH 8.0）洗脱再测，这是金标准
四类下游实验的”接受/重做”决策
| 下游 | A260/280 | A260/230 | 浓度范围 | 不满足时的对策 |
|---|---|---|---|---|
| 普通 PCR/RT-PCR | 1.6–2.1 | ≥ 1.3 | 10–200 ng/µL | 稀释 1:5 后重做；仍失败则重纯化 |
| qPCR/NGS 建库 | 1.7–2.0 | ≥ 1.8 | 1–100 ng/µL | 柱纯化（QIAquick 类） |
| 酶切/连接/克隆 | 1.75–1.95 | ≥ 1.8 | 20–500 ng/µL | 酚氯仿 + 乙醇沉淀 |
| 质粒转染/病毒包装 | 1.8–1.9 | ≥ 2.0 | 200–1000 ng/µL | 中提试剂盒重做，或 CsCl 超速离心 |
实操建议：如何读取 NanoDrop 更准确
- 空白必须用洗脱液（TE 或洗脱缓冲液），不要用纯水
- 测样前用 1 µL 空白液先擦一下基座，再上样 1–2 µL
- 做三次复孔，取均值；三次 A260 相差 >10% 说明混匀不好
- 关注图谱形状：正常核酸是 260 nm 处单峰、230 处低值；若 270–280 nm 有肩峰 → 酚残留；若 260 峰拖尾到 300 nm → 高盐/胍盐
- RNA 样品注意 28S/18S 峰高（Bioanalyzer 或胶图），NanoDrop 看不到降解
一句话总结
280 不好=蛋白/酚 → 再抽提或过柱；230 不好=盐/胍 → 乙醇沉淀或透析；两个都不好→重抽；过高不是纯，是 RNA 污染或降解。
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