FFPE 样本为什么难提 RNA
福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）是临床病理样本最常用的保存方式，存量巨大、可回溯性强，但从 FFPE 中提取高质量 RNA 难度远高于新鲜或冻存组织，核心原因有三个：
1. 福尔马林交联导致 RNA-蛋白结合
福尔马林（甲醛）会在 RNA 与蛋白质之间、RNA 分子之间形成亚甲基桥交联，使 RNA 被固定在蛋白网络中。常规裂解液很难将 RNA 释放出来，必须通过高温解交联才能打破这些共价键。
2. RNA 严重降解
固定过程中内源 RNase 未被完全失活，且固定、脱水、包埋的多步操作都可能引入降解。FFPE 样本的 RNA 完整性（RIN）通常只有 2-4，远低于新鲜组织的 8-10。
3. 石蜡残留与小分子污染
脱蜡不彻底会留下石蜡残留，抑制下游酶反应；福尔马林的小分子降解产物（如甲酸、甲醇）会导致 A260/230 偏低，影响浓度测定准确性。
FFPE RNA 质量预期
做 FFPE RNA 之前，先调整心理预期：
| 指标 | 新鲜组织 | FFPE 组织（1 年内） | FFPE 组织（5 年以上） |
|---|---|---|---|
| RIN | 8-10 | 4-6 | 2-3 |
| A260/280 | 1.9-2.1 | 1.8-2.0 | 1.6-1.9 |
| A260/230 | 2.0-2.4 | 1.2-1.8 | 0.8-1.4 |
| 平均片段长度 | >2000 nt | 200-500 nt | 100-200 nt |
| 得率（每 10 μm 切片） | - | 1-10 μg | 0.1-1 μg |
结论：不要指望 FFPE 提取出完整 RNA，目标应该是拿到片段化但可用于 qPCR（扩增子 <200 bp）或 RNA-seq 的短片段 RNA。
FFPE RNA 提取优化 SOP
一、样本前处理：切片与脱蜡
切片厚度
| 用途 | 推荐切片厚度 | 备注 |
|---|---|---|
| 总 RNA 提取 | 5-10 μm | 太厚裂解不充分，太薄细胞量不够 |
| 微量样本（穿刺） | 10 μm | 尽量切厚，增加细胞量 |
切片时用一次性刀片，避免交叉污染。载玻片用 RNase-free 规格。
脱蜡
石蜡是 RNA 提取的最大物理障碍，必须彻底去除。
二甲苯脱蜡法（经典）：
- 切片放入二甲苯，室温 5 min，重复 2 次
- 100% 乙醇 5 min，2 次（置换二甲苯）
- 95% 乙醇 5 min
- 75% 乙醇 5 min
- 空气干燥或 37°C 烘干 5-10 min
无二甲苯脱蜡法（更安全）：
用商业化脱蜡液（如 CitriSolv、Histo-Clear）或正庚烷替代二甲苯，毒性更低，效果相当。
脱蜡不彻底的标志：
- 裂解液浑浊，有白色絮状物
- 离心后有机层残留
- A260/230 <1.0
二、裂解与解交联（最关键步骤）
FFPE RNA 提取的核心是解交联，需要高温 + 蛋白酶 K 共同作用。
裂解体系
| 成分 | 作用 | 条件 |
|---|---|---|
| 裂解液（含胍盐/SDS） | 破膜、变性蛋白 | 按试剂盒说明 |
| 蛋白酶 K | 消化蛋白、释放 RNA | 20-50 μL（20 mg/mL） |
| 解交联温度 | 打破亚甲基桥 | 55-70°C |
| 解交联时间 | 充分释放 RNA | 30 min - 过夜 |
解交联温度与时间优化
| 固定时间 | 解交联温度 | 解交联时间 | 备注 |
|---|---|---|---|
| <24 h | 55°C | 30-60 min | 轻度交联 |
| 24-48 h | 65°C | 1-2 h | 标准条件 |
| >48 h 或陈旧样本 | 70°C | 2-4 h 或过夜 | 充分解交联 |
温度不是越高越好：超过 70°C 会加速 RNA 降解。推荐 65°C 解交联 1-2 h，兼顾效率与完整性。
蛋白酶 K 的用量
| 组织量 | 蛋白酶 K 用量 |
|---|---|
| 1-2 张切片（10 μm） | 20 μL（20 mg/mL） |
| 3-5 张切片 | 30-50 μL |
| 穿刺样本（细胞量少） | 20 μL |
蛋白酶 K 不足会导致 RNA 释放不充分，得率低；过量则浪费且可能残留影响纯化。
三、RNA 纯化
解交联后，按常规 RNA 纯化流程（柱式或 TRIzol）提取。FFPE 样本推荐使用商业化 FFPE RNA 提取试剂盒（如 Qiagen RNeasy FFPE、Ambion RecoverAll），因为：
- 试剂盒的裂解液针对交联样本优化
- 柱式纯化能有效去除石蜡残留和小分子
- 通常含 DNase I 处理步骤，去除基因组 DNA
DNase I 处理
FFPE 样本中基因组 DNA 与 RNA 交联在一起，常规柱纯化难以完全去除。必须在柱上或柱后用 DNase I 处理 15-30 min，否则 qPCR 会出现基因组 DNA 扩增。
四、RNA 质量评估
NanoDrop 初筛
用 OD260 核酸浓度计算器 测定浓度和纯度。FFPE 样本重点看：
| 指标 | 合格标准 | 不合格处理 |
|---|---|---|
| A260/280 | ≥1.8 | 偏低说明蛋白残留，增加纯化次数 |
| A260/230 | ≥1.0 | 偏低说明盐/石蜡残留，增加洗涤次数 |
注意：FFPE 样本的 A260/230 通常偏低，不要用新鲜组织的标准（>2.0）来要求 FFPE，只要 ≥1.0 且 qPCR 能扩增即可。
完整性评估
| 方法 | 适用 | FFPE 判断标准 |
|---|---|---|
| 琼脂糖凝胶电泳 | 快速 | 无明显 18S/28S 条带，呈 smear 属正常 |
| Bioanalyzer | 精确 | RIN 2-4 可用于 qPCR，<2 需重新提取 |
| qPCR 内参扩增 | 功能验证 | Ct <30 且扩增曲线正常即可用 |
最实用的判断：用内参基因（如 GAPDH、β-actin，扩增子 100-150 bp）做 qPCR，如果 Ct <30 且熔解曲线单一，说明 RNA 质量满足 qPCR 需求。
下游应用的 RNA 质量要求
| 下游应用 | 对 FFPE RNA 的要求 | 建议扩增子长度 |
|---|---|---|
| qPCR（基因表达） | RIN ≥2，内参 Ct <30 | 100-150 bp（<200 bp） |
| 一步法 RT-qPCR | 同上 | 100-150 bp |
| RNA-seq | RIN ≥3，总量 ≥100 ng | 建库试剂盒需兼容 FFPE |
| 小 RNA 测序 | RIN ≥2，总量 ≥500 ng | miRNA 较稳定，FFPE 中保留较好 |
| 全长转录组 | 不推荐 | FFPE RNA 片段化严重 |
核心原则：FFPE RNA 用于 qPCR 时，扩增子一定要短（<150 bp），因为长片段在交联和降解过程中断裂，无法有效扩增。
常见问题排查
问题 1：RNA 得率极低
可能原因：
- 切片太薄或细胞量太少
- 脱蜡不彻底，裂解液无法进入组织
- 解交联不充分（温度不够或时间太短）
- 蛋白酶 K 失活或用量不足
解决方案：
- 增加切片数量（3-5 张）或切厚（10 μm）
- 延长脱蜡时间，确保石蜡完全溶解
- 提高解交联温度至 65°C，时间延长至 2 h
- 更换新的蛋白酶 K，现用现配
问题 2：A260/230 偏低（<1.0）
可能原因：
- 石蜡残留
- 胍盐残留（洗涤不充分）
- 福尔马林小分子残留
解决方案：
- 脱蜡后用乙醇充分置换二甲苯
- 柱纯化时增加洗涤次数（2-3 次 75% 乙醇）
- 用氯仿抽提一次再上柱（TRIzol 法）
- 过柱后用 30-50 μL 水预洗一次再洗脱
问题 3：qPCR 完全无扩增
可能原因：
- RNA 严重降解，目标片段已断裂
- 扩增子太长（>300 bp）
- 逆转录酶被抑制剂（石蜡、福尔马林残留）抑制
- 基因组 DNA 污染，但引物跨内含子所以无信号
解决方案：
- 设计更短的扩增子（100-120 bp）
- 用内参基因验证 RNA 是否可用
- 增加 RNA 投入量或重新提取
- 检查逆转录酶是否失活，换用耐抑制剂的逆转录酶
问题 4：qPCR Ct 值偏高且重复性差
可能原因：
- RNA 片段化不均，逆转录效率不稳定
- 模板量不足
- 抑制剂残留影响酶活性
解决方案：
- 增加 RNA 模板量（逆转录时用 1-2 μg）
- 用随机引物而非 Oligo(dT) 做逆转录，因为 FFPE RNA 的 polyA 尾可能已断裂
- 增加 cDNA 模板量，但注意不要超过 qPCR 体系的 10%
固定条件对 RNA 质量的影响（从源头控制）
如果能控制样本固定流程，以下条件能显著提高后续 RNA 质量：
| 固定参数 | 推荐条件 | 不佳条件的影响 |
|---|---|---|
| 固定液 | 10% 中性缓冲福尔马林（NBF） | 酸性福尔马林加速 RNA 降解 |
| 固定时间 | 12-24 h | >48 h 交联过度，RNA 难以释放 |
| 固定温度 | 室温 | 高温加速降解 |
| 组织厚度 | <5 mm | 太厚固定不均，内部自溶 |
| 包埋温度 | <60°C | 高温石蜡加速 RNA 降解 |
如果样本已经固定完成无法改变，就只能靠提取阶段的优化来弥补。
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