做之前先确认这些
- RNA 质量已测过：RIN > 7、A260/280 1.8–2.0、A260/230 > 1.5
- 引物已用标准曲线验证过：效率 90–110%、R² > 0.99、熔解曲线单峰
- 内参基因在你这套组织 / 处理 / 时间点条件下做过稳定性验证，而不是直接抄 GAPDH
- cDNA 已做过梯度预实验，确认了合适的稀释比落在标准曲线线性区间
- 板图已规划好：NTC、NRT、至少 3 个技术重复，关键样本避开最外圈孔
最常见的坑
- RNA 质量将就：降解或纯度不达标的 RNA，会让 Ct 漂、重复性差，后面再优化反应体系也救不回来
- 引物不验证直接上：文献或公司给的序列不验证效率，结果可能只有 70% 或 130%，定量全错
- 内参拍脑袋选 GAPDH：处理条件一变，内参稳定性立刻垮，相对定量结果不可信
- cDNA 不做梯度预实验：模板量不在标准曲线线性区间，效率算出来也是假的
- NTC 和 NRT 缺一不可：NTC 检污染和引物二聚体，NRT 检基因组 DNA 残留，少一个都查不清问题
- 技术重复少于 3 个：少一个点就没法判断是技术误差还是样本异常，复孔差异大于 0.5 个 Ct 直接作废
- 加样顺序随便：先加酶后加模板的偏差，比加样误差本身还大，主反应试剂要一次性配 master mix
- 熔解曲线跳过：不做熔解曲线分析，多峰和引物二聚体全被发现不了
- 标准曲线浓度范围太窄：覆盖不了真实样本的浓度，外推出来的定量值误差极大
- Plate 边缘效应：关键样本放在最外圈孔（A1、H12 等），边缘蒸发和温度梯度差异让 Ct 漂 0.3–0.5
每一步的关键细节
- RNA 抽提后：先跑凝胶或 Bioanalyzer 看 28S/18S 比值，再用 NanoDrop 测纯度，不达标先重提
- 引物验证：做 5–6 个 10 倍梯度稀释的标准曲线，用 引物二聚体检测 工具查二聚体和发夹
- 内参验证：至少测 2–3 个候选内参，用 GeNorm 或 NormFinder 算稳定性（M < 0.5）
- cDNA 梯度预实验：原液、1:5、1:10、1:20 各做一孔，看 Ct 落点，再用 系列稀释计算 排标准曲线
- 加样顺序：master mix 先加到各孔，最后加模板，从低浓度到高浓度，模板之间换枪头
- 熔解曲线：每孔都要看，不只看代表孔
- 板图设计：标准曲线放中间区域，关键样本避开最外圈，可用 稀释计算器 提前算好每孔加量
出了问题怎么办
实验跑完发现数据异常，按以下顺序排查：Ct 偏高先看 RNA 质量和模板稀释比（qpcr-ct-high）；复孔差异大看加样和板图布局（qpcr-ct-variation）；扩增效率低重新做引物验证（qpcr-efficiency-low）；R² 低检查梯度稀释准确性（qpcr-r2-low）；标准曲线异常参考 qpcr-standard-curve；整体设计思路见 qpcr-experimental-design 和 qpcr-data-quality-control。
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本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。