先选浓度：这是唯一不能凭习惯决定的一步
胶浓度决定孔径，孔径决定分离范围。浓度选错时，后面所有操作都救不回来。
| 琼脂糖浓度 | 最佳分离范围 | 典型用途 |
|---|---|---|
| 0.5% | 1-30 kb | 大片段、基因组 DNA 检查 |
| 0.8% | 0.5-10 kb | 常规质粒、PCR 产物（默认选择） |
| 1.0% | 0.25-8 kb | 常规 PCR 产物、酶切鉴定 |
| 1.5% | 0.2-4 kb | 小片段、菌落 PCR |
| 2.0% | 0.1-2 kb | 小片段精细分离 |
| 2.5-3.0% | 50-500 bp | 极小片段、需要高分辨时 |
判断方法：目标片段在范围上限附近时分离度最好。例如一个 3 kb 的片段，用 0.8% 或 1.0% 都可以；如果同时要看 500 bp 和 200 bp 的差异，就需要 1.5%-2.0%。
不同浓度下条带位置与分辨率的对比，见 核酸电泳胶浓度怎么选。
二、标准制胶步骤
准备
- 算出所需胶量：胶体积 = 制胶槽长 × 宽 × 胶厚。常用小胶槽（约 7 × 10 cm、厚 5 mm）需要约 35-40 mL；
- 确认缓冲液是 1× 工作液：TAE 或 TBE 母液必须稀释到 1× 再用于配胶，用错浓度会导致胶不凝固或电泳异常；
- 称量琼脂糖：按体积和浓度称，例如 40 mL 的 1% 胶需要 0.4 g。
操作
称量琼脂糖 → 加入 1× 缓冲液 → 微波加热至完全溶解
→ 冷却至约 60°C → 加核酸染料 → 灌胶 → 插梳子 → 室温凝固 20-30 分钟逐步要点：
- 加热溶解：微波炉中火间断加热，每 20-30 秒取出摇匀一次，直到溶液完全透明无颗粒。煮沸溢出是常见事故，容器不要装超过一半体积；
- 补足蒸发水分：加热过程会蒸发水分，用去离子水补回到原体积。这一步最容易被跳过，而它正是”同一浓度配出来分离效果不稳定”的原因；
- 冷却到 60°C 左右：手感是能握住容器但明显烫。温度过高会损伤核酸染料、也会让制胶槽变形；
- 加入染料：按说明书比例加入预染型染料（如 GelRed、SYBR Safe）。EB 等致癌性染料必须戴手套并在通风处操作，染料选择与用量见 核酸染料参考；
- 灌胶：缓慢、连续地从一角倒入，避免产生气泡。如果有气泡，用枪头或移液枪轻轻推到边缘；
- 插梳子：梳子从一端倾斜插入，避免带入气泡。梳齿离底板留 0.5-1 mm，完全贴底会导致孔底漏液、样品流失；
- 凝固：室温静置 20-30 分钟至完全凝固（胶体由透明变为微乳白，轻触不粘手）。低浓度胶需要更长时间。
凝固后
- 小心垂直拔出梳子，避免撕裂孔壁；
- 将胶连同托盘放入电泳槽，加入没过胶面 2-3 mm 的 1× 缓冲液；
- 若不能立即跑胶，可连同缓冲液 4°C 短存，但不要干放。
上样前的检查项见 核酸电泳上样前要检查哪些细节，电泳条件见 电泳电压和跑胶时间怎么设。
三、常见失败与对应处理
| 现象 | 最常见原因 | 处理方式 |
|---|---|---|
| 胶长时间不凝固 | 缓冲液用了母液（如 10×）、琼脂糖过期或受潮、浓度配错 | 用 1× 工作液重配，更换新琼脂糖 |
| 胶很脆、易碎 | 浓度过高、缓冲液离子强度异常、凝固时间不足 | 降低浓度，确认缓冲液为 1×，延长凝固时间 |
| 孔底漏胶、样品流失 | 梳齿贴底太紧、胶未完全凝固就拔梳子 | 重新插梳子留 0.5-1 mm 间隙，延长凝固时间 |
| 胶内有气泡 | 灌胶过快、加热后未消泡、倒胶时有气流 | 灌胶前静置消泡，缓慢倒胶并把气泡推向边缘 |
| 条带拖尾、弥散 | 胶浓度过低、缓冲液重复使用过多次、电压过高 | 提高浓度，更换缓冲液；详见 条带拖尾弥散排查 |
| 条带弯曲或笑脸 | 电压过高、缓冲液老化、胶厚不均 | 降低电压，重配缓冲液；详见 笑脸条带怎么办 |
| 孔壁破损、条带起步不齐 | 拔梳子拉扯、上样枪头戳破孔壁 | 垂直拔梳，上样时枪头贴孔壁缓慢注入 |
四、容易被忽略的三个细节
1. 缓冲液种类影响分辨率
- TAE：缓冲能力弱但分辨率好，适合需要回收 DNA 的场景（大片段分离更清晰）；
- TBE：缓冲能力强、适合长时间跑胶和小片段高分辨，但硼酸会影响后续酶反应，回收后需纯化。
选择逻辑与电泳缓冲液配制见 电泳缓冲液和上样条件怎么检查 与 缓冲液配方查询。
2. 缓冲液重复使用有次数上限
同一份电泳缓冲液重复使用会累积离子消耗和杂质，表现为条带变钝、分辨率下降、pH 漂移。建议同一份缓冲液使用不超过 2-3 次，出现条带变形或跑速变慢就更换。
3. 胶厚影响灵敏度与分辨率
胶越厚，上样体积可以越大、灵敏度越高，但分辨率下降、染色和脱色时间都要延长。需要高分辨时用薄胶配小体积上样，需要检测微量样品时用厚胶。
五、配胶量的快速计算
需要的琼脂糖质量按下式计算：
琼脂糖质量(g) = 胶体积(mL) × 浓度(%)例如：
| 胶体积 | 0.8% | 1.0% | 1.5% | 2.0% |
|---|---|---|---|---|
| 30 mL | 0.24 g | 0.30 g | 0.45 g | 0.60 g |
| 40 mL | 0.32 g | 0.40 g | 0.60 g | 0.80 g |
| 50 mL | 0.40 g | 0.50 g | 0.75 g | 1.00 g |
| 100 mL | 0.80 g | 1.00 g | 1.50 g | 2.00 g |
需要把缓冲液母液稀释成工作液时，用 缓冲液配制计算 算出母液和水的体积比例。
六、什么时候需要重新配胶
- 胶出现明显气泡、裂纹或孔壁破损；
- 胶放置超过一天（尤其已脱水的胶），孔径和含水量已改变；
- 配置过程中水分蒸发未补，实际浓度高于目标值；
- 缓冲液浓度存疑（例如不确定是否稀释到 1×）；
- 同一批胶连续两次出现条带异常，且已排除样品和上样问题。
凝胶跑完后如何染色、成像以及短期保存，见 凝胶染色与成像完整指南 和 电泳结果保存问题。
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