什么是做之前先确认这些？

做之前先确认这些。详见文章「RNA 提取避坑清单：开始前必须注意的 11 件事」中的详细分析与排查方案。

什么是最常见的坑？

最常见的坑。详见文章「RNA 提取避坑清单：开始前必须注意的 11 件事」中的详细分析与排查方案。

什么是每一步的关键细节？

每一步的关键细节。详见文章「RNA 提取避坑清单：开始前必须注意的 11 件事」中的详细分析与排查方案。

RNA 提取避坑清单：开始前必须注意的 11 件事——出了问题怎么办怎么办？

出了问题怎么办。详见文章「RNA 提取避坑清单：开始前必须注意的 11 件事」中的详细分析与排查方案。

RNA 提取避坑清单：开始前必须注意的 11 件事

Q: RNA 提取避坑清单：开始前必须注意的 11 件事

做 RNA 提取前把 RNase 防控、试剂比例、相分离、沉淀、洗涤和保存这些环节想清楚，能避免 RIN 低、A260/230 偏低和反复降解。

做之前先确认这些

器械已处理：玻璃器皿 200°C 干烤 ≥ 4 h，塑料耗材用 DEPC 水浸泡或买 RNase-free 规格
操作区域干净：有 RNase-free 专区，台面用 RNase Away 喷擦
样品处理路径明确：新鲜样品立即裂解，或液氮速冻后 -80°C 保存，不反复冻融
TRIzol / 裂解液比例已算好：1 mL per 5–10 × 10⁶ 细胞，或 1 mL per 50–100 mg 组织
异丙醇、75% 乙醇已预冷（-20°C），RNA 溶解水已确认是 RNase-free

最常见的坑

RNase 防控不到位：RNase 无处不在，器械没干烤、台面没擦、手套没换，微量残留就能降解整管 RNA
操作区域不专用：在跑过 PCR 或切过组织的台面上提 RNA，气溶胶和接触污染瞬间让样品报废
样品反复冻融：-80°C 取出 → 融 → 再冻，每次都让 RIN 掉一截；新鲜样品没及时裂解，内源 RNase 开始工作
TRIzol 比例不对：细胞数过多或组织量过大，裂解不彻底，相分离也分不清
相分离等不足：加氯仿后没静置够 5 min 就离心，水相和有机相分不开
吸到中间层：吸水相时贪多，把蛋白层和有机相带过去，纯度直接崩
异丙醇沉淀温度不够低：室温沉淀或时间太短，低浓度 RNA 沉不下来，得率骤降
75% 乙醇洗涤不充分：残留盐和胍盐影响 A260/230 和下游酶反应
用 DEPC 水溶解 RNA：DEPC 残留会抑制下游逆转录和 PCR，必须用 RNase-free 纯水
测浓度前不离心：管底有不溶物直接测 NanoDrop，吸光值虚高
反复冻融 RNA 样品：保存不分装，每次取用都解冻一次，RIN 直线下降

每一步的关键细节

器械处理：玻璃 200°C 干烤 4 h；塑料用 0.1% DEPC 水浸泡过夜后高压灭菌 15 min
操作环境：戴口罩和双层手套，操作中说话避免；枪头、离心管全程用 RNase-free 规格
样品处理：组织离体后 5 min 内液氮速冻；细胞直接吸培养基加 TRIzol 裂解，不需要 PBS 洗第二次
TRIzol 比例：6 cm 皿（约 5 × 10⁶ 细胞）用 1 mL；组织每 50–100 mg 用 1 mL，匀浆要彻底
相分离：加氯仿（1 mL TRIzol 加 200 μL 氯仿），盖紧剧烈振荡 15 s，室温静置 5 min 再 4°C 12 000 g 离心 15 min
吸水相：吸上清的 70–80% 即可，宁可少吸不要吸到中间层；枪头换新的，吸一管换一次
异丙醇沉淀：-20°C 30 min 或 -80°C 15 min，低浓度样本延长到 1 h；离心后弃上清留底部白色 pellet
75% 乙醇洗涤：用 -20°C 预冷的 75% 乙醇，弹起 pellet 后 4°C 7 500 g 离心 5 min，洗涤 2 次
RNA 溶解：用 RNase-free 纯水（不要用 DEPC 水），10–50 μL 视 pellet 大小调整，静置 5 min 让其充分溶解
测浓度：先用 NanoDrop 测 A260/A280/A230，用 OD260 核酸浓度计算器换算浓度和纯度；RIN 鉴定上 Bioanalyzer 或跑普通凝胶
保存：分装成 5–10 μL / 管，-80°C 冻存，每次取一管用完即弃，不要回冻

出了问题怎么办

提取结果异常按以下顺序排查：RIN 低或降解先看采集和裂解时机（rna-degradation-troubleshooting）；完整性判断见 rna-integrity-assessment；A260/230 低查洗涤和沉淀（nanodrop-ratio-interpretation-decision）；纯化脱盐见 nucleic-acid-purification-desalting-strategies；浓度测定见 nucleic-acid-quantitation；流程总览参考 rna-extraction-guide；DNA/RNA 共提参考 dna-rna-co-extraction。

继续用工具完成条件判断和计算

OD260 核酸浓度计算器

根据 OD260 吸光度值和比色皿光径，快速换算 DNA / RNA 浓度（ng/µL），并给出纯度比值判断。

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下一步排查

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本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。